性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光, 当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光, 囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加, 而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。本方法的缺点是背景荧光较大, fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。另一种方法是通过基因转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡的运动过程［5］。例如, 将GFP基因与囊泡特异的前胰岛素基因整合后转入胰岛INS-1 β-细胞中进行表达,然后用荧光成像技术实时研究活分泌囊泡的转移、 锚定和胞吐过程。此外还有免疫荧光标记法: 多巴胺β羟化酶(DBH)在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面, 随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合, 就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。1.4胞内信号分子光解方法
细胞分泌活动受很多因素的调控, 采用信使物质瞬时释放的方法［6］,可以定量研究各因素对分泌的影响。神经递质的分泌与细胞钙离子浓度紧密偶联(与钙离子浓度的3～4次方成正相关)。Ca2＋螯合物DM-nitrophen和Nitrophenyl eGTA可用于快速而均匀地提升细胞内钙离子浓度, 将这些物质与Ca2+染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内, 然后经高能量的紫外光激发,便能产生一个迅速的、阶跃性的钙升高,并且整个细胞钙浓度都会均一地升高。这克服了单纯电刺激引起的离子通道附近产生不同的钙微区的缺点。DM-nitrophen在光解前对Ca2+有很高的亲和力,对静息的细胞钙缓冲几乎没有影响, 是研究细胞钙缓冲和钙稳态系统的非常理想的材料。通过控制激发紫外光的强度, 可以用来进行细胞内钙离子浓度滴定,也可用于钙结合力测定以及其他许多钙依赖的细胞功能活动。但是它易受Mg2+结合的影响。而Nitrophenyl EGTA对Ca2+有更高的选择性,但它在光解前对Ca2+亲和力较低, 且不易被光解产生大的Ca2+阶跃。除了Ca2+外, 许多第二信使如cAMP等都可用该方法对其细胞内浓度进行精确控制。
2 免疫细胞分泌的细胞和分子机制
2.1 免疫细胞的离子通道和细胞功能
免疫细胞不属于可兴奋性细胞(如神经细胞、 肌肉细胞等)之列, 但也具有某些与神经细胞相类似的电生理特性。离子通道的活动与离子跨膜流动、膜电位的变化以及随后的淋巴细胞激活密切相关。在大多数淋巴细胞上存在有不同的离子通道, 这些离子通道类似于神经细胞以及肌肉细胞的离子通道,但又有其自身的特点。Na通道仅存在于少数T细胞、 T细胞株和自然杀伤细胞。电压依赖性K通道存在于大多数T淋巴细胞、 T淋巴细胞株和巨噬细胞［7］,类似于神经细胞上的延迟整流K通道特性。 根据其电压激活和灭活的动力学特性以及药理学特征可分为3种亚型, 它们随细胞的发育状态和功能分类不同而有所变化,可能与细胞有丝分裂有关。丝裂酶原刺激后24 h可使K电流增大; K通道阻断剂则能剂量依赖性地抑制有丝分裂和抗原引发的淋巴细胞的激活,可能是“K通道开放-细胞膜去极化-Ca2+通道开放”通路被抑制后细胞外Ca2+内流减少所致［8］。Ca2+激活的K通道K(Ca)则由丝裂酶原引起的细胞Ca2 +浓度升高激活,进而引发K外流和细胞膜的超极化。电压依赖性Ca通道仅在B淋巴细胞上存在, 而在T淋巴细胞以及T淋巴细胞株均未见报道;但T淋巴细胞上存在一种非电压依赖性的Ca2+通道, 由T细胞抗原所激活, 然后通过第二信使IP3, 引发细胞内Ca2+库释放,增强Ca2+离子跨膜内流或Ca2+依赖性灭活。
目前, Ca2+作为细胞内较早激活的一个重要的第二信使已被接受, 但其后续信号过程尚不清楚。T细胞的Ca2+信号可分成两相:快速的Ca2+峰和随后的Ca2+平台, 前者由细胞内钙库的释放引起, 后者则由CRAC引发的持续跨膜Ca2+内流引起。单细胞上的钙信号可表现为反复的钙振荡,这可能是一种通过频率编码来传递信息的方式。钙信号的频率特性可通过几种非线性反馈系统来调控, 如PKC介导的CD3γ亚基的磷酸化负反馈(可反馈抑制TCR/CD3的功能)、 ca2+信号放大正反馈(内质网Ca2+的释放和同时发生的CRAC以及PLC的进一步激活)、 ca2+离子的自身负反馈。关于G蛋白是否介导“TCR/CD3-PI水解-Ca2+动员”信号通路, 尚是一个悬而未决的问题,一些间接证据表明T细胞的激活需要G蛋白的参与, TCR/CD3可能在结构上形成G蛋白偶联受
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