苷(ganciclovir,GCV)和无环鸟苷(acyclovir,ACV)变为具有细胞毒性的三磷酸形式，从而杀死肿瘤细胞，不仅如此，还存在着旁观者效应(bystander effect)，即不仅转染了目的基因的细胞可以被杀死，周围未被转染的细胞也可被杀死［1］ 。本研究旨在应用复制缺陷型腺病毒载体将HSV1-tk基因导入卵巢癌细胞株(OEC)TYK中，观察腺病毒/HSV1-tk/GCV、ACV系统的旁观者效应。
1 资料与方法
1.1 重组腺病毒 Adtk、AdLacZ购自复旦大学遗传所基因治疗组。其中Adtk是PAdHCMV-tk与JM17质粒共转染293细胞后，经过同源重组、挑取单噬斑得到的。
1.2 试剂及细胞株 OEC细胞株TYK由日本医科大学提供。人胚肾293细胞购自复旦大学遗传所基因治疗组。293细胞、TYK细胞均用含10%胎牛血清及双抗(青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml)的DMEM培养液培养。GCV为Roch Syntex公司产品。ACV为湖北潜江制药厂产品。HSV1-tk的PCR扩增引物由北京医科大学合成，引物序列为：上游5’CTACACCACACAACACCGCCTC3’，下游5’TCGCAGCCAGCATAGCCAGGTC3’。
1.3 重组腺病毒扩增、纯化及病毒滴度的测定 两种重组腺病毒分别感染对数生长期的293细胞，培养4d后，收集细胞及上清，液氮中反复冻融数次，氯化铯超密度梯度离心纯化病毒，快速CPE法结合噬斑分析法测定病毒滴度［2］。
1.4 重组腺病毒对离体细胞转染效率的检测 TYK细胞接种24h后，加入不同感染复数(0，20，50，100，150，200)的AdLacZ,3h后，换新鲜普通培养液，48h后，作常规X-gal染色，光镜观察，取1000个细胞计算各滴度转入的细胞感染率。
1.5 PCR扩增检测HSV1-tk的表达 以感染复数(mutiplication of infection,MOI)为100的重组腺病毒感染接种24h后的TYK细胞，24h后，收集104待测细胞常规去蛋白、变性处理，进行PCR扩增。具体条件为：65℃10s退火，加1.5?U?DNA聚合酶，70℃90s延伸，以后按94℃15s，63℃15s，70℃90s，重复进行35个周期。反应完成后，点样于1.8%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6 Adtk/TYK/ACV、GCV系统产生的旁观者效应观察 用MOI为100的Adtk转染TYK细胞，24h后，将Adtk/TYK细胞与TYK细胞分别以不同比例(0，2%，5%，10%，25%，50%，75%，100%)混合，接种于96孔板，培养24h后，每个混合比例的细胞分别换成含ACV50μg/ml或GCV10μg/ml的培养液，4d后，用MTT法计算细胞存活率，观察旁观者效应。对照组选用AdLacZ/TYK细胞。
2 结 果
2.1 重组腺病毒的制备及滴度测定 病毒大量扩增并纯化，测定Ad/tk滴度为6.2×109pfu/ml，AdLacZ滴度为1.4×109pfu/ml。
2.2 重组腺病毒转染效率的检测 AdlacZ与Adtk仅在于靶基因不同，用AdLacZ转染TYK细胞后，给予X-gal染色，可判断重组病毒的转染效率。LacZ基因转染入细胞并被表达后，细胞可被X-gal染成蓝色。我们用MOI分别为0，20，50，100，150，200的AdLacZ重组腺病毒感染TYK细胞后，得出转染效率分别为0，51.2%，71.2%，98.9%，99.3%，99.6%，提示，MOI为100时，近100%的细胞可被感染。
2.3 Adtk感染TYK后PCR扩增检测 PCR产物1.8%琼脂糖凝胶电泳显示，Adtk转染TYK后，可见长度为404bp的特异性条带，而AdLacZ转染TYK则未见相关条带，结果见图1。
图1 Adtk感染TYK细胞后PCR扩增结果
2.4 Adtk/TYK/ACV、GCV系统产生的旁观者效应 用MOI为100的Adtk感染TYK细胞后与TYK细胞混合培养，GCV、ACV对不同比例的细胞存活率见图2。
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