Ad Ela对SKOV3细胞的转染效率及体外杀伤作用

1　材料与方法

1.1　Lipofectin介导重组腺病毒载体［2］　已构建好的转移质粒pEla与克隆了的腺病毒基因组质粒pJM17共转染293细胞中，进行同源重组。(1)pAd.CMV或pEla与pJM17用lipofectin共转染293细胞。收获293细胞，将(1～2)×105细胞重悬于2ml完全培养液中，转种于6孔板中，37℃，5%CO2培养箱培养24h，使细胞50%～80%融合；在无菌玻璃试管中制备溶液A，将2～20μl质粒DNA溶于100μl无血清培养基中，溶液B，20μl lipofectin稀释于80μl无血清培养基中；合并溶液A、B，轻轻混合置室温15min；弃去细胞培养液，并用无血清培养基洗涤细胞1次；加0.8ml无血清培养基至lipofectin-DNA混合物中，混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀；37℃，5%CO2培养箱培养5h；弃去转染液，加2ml完全培养基继续培养；(2)2d后以0.5%Agarose的DMEM覆盖293细胞，并添加完全DMEM；(3)10d后腺病毒出现半透明空斑，挑出蚀斑，溶于PBS2+中，感染293细胞进行腺病毒扩增。
1.2　重组腺病毒的扩增和纯化　培养对数期生长的293细胞，至瓶满度70%～80%，换以不含血清的DMEM培养液，同时加入同源重组得到的腺病毒初提液感染293细胞，37℃、5%CO2条件下培养48h，镜下可观察到293细胞呈特征性的细胞病变反应(细胞肿胀、变圆、脱落、聚集成团)；收集细胞，经液氮3次冻融后离心，制备到大量扩增的重组腺病毒初提液。
　　氯化铯密度梯度离心法连续两次纯化重组腺病毒颗粒［3］，收集到的腺病毒在0.01mol Tris-Hcl(pH 8.1)中去离子透析后，加入20%的甘油，-20℃保存备用。
1.3　腺病毒滴度测定　腺病毒滴度测定采用细胞病变法［3］。
1.4　重组腺病毒在离体培养细胞基因转染率　SKOV3细胞置24孔板，104/孔常规培养24 h后换以无血清培养基，不同滴度的Ad.lacZ［4］,37℃，5%CO2条件下培养，培养48h后，PBS清洗细胞，2%多聚甲醛固定10min，作X-gal染色，计数5个高倍镜视野下，核蓝染细胞和未蓝染细胞的比例，能直观地反映腺病毒基因转染细胞的能力。同法104/孔SKOV3细胞，20：1 V/T比值的Ad.lacZ每天感染1次，连续1～4d,比较不同感染次数的转染效率。
1.5　X-gal染色方法　用0.5%戊二醛在室温下固定10min，然后用PBS2+洗2次，每次10min，加X-gal染色液37℃过夜。
1.6　Ad.Ela体外抑制肿瘤细胞生长试验　103/孔的SKOV3细胞置入24孔板，以20：1的V/T浓度的Ad.Ela+感染(另设Ad.Ela-和PBS2+组)1次。三复孔计数连续7d，并描绘生长曲线。取上述方法感染2d后的细胞约106，FACS检测Ela治疗后HER-2/neu基因表达。

2　结　果

2.1　腺病毒载体的转染效率　Ad.RSVlacZ感染SKOV3细胞，V/T比值达到20：1时，感染效率急剧上升至81%，此后曲线趋于平台，增加病毒浓度效率未明显增加；以20：1的病毒感染一次效率即可达到73.2%，多次感染并不能显著增加感染效率，见图1。

图1　腺病毒载体的转染效率(A)不同V/T比值的Ad.RSVlacZ转染SKOV3的效率。
(B)V/T为20时，不同感染次数Ad.RSVlacZ感染SKOV3的效率。

2.2　Ad.Ela对SKOV3细胞系的抑制作用　每孔103 SKOV3细胞，以2×104Ad.Ela+一次性感染。每天记录双复孔细胞数，连续7d，描绘生长曲线，以Ad.Ela-作为实验对照，PBS2+空白对照。结果见图2。Ad.Ela+体外明显抑制SKOV3(HER-2/neu高表达)的生长，实验对照和空白对照组未见生长抑制。

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