细胞凋亡和P53在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达

1　材料和方法

1.1　材料　收集本院病理室1995至1997年宫颈癌活检及手术切除之石蜡包埋组织，浸润性宫颈鳞癌(ISCC)52例，宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ/Ⅱ22例，CIN Ⅲ16例，正常宫颈15例，患者18～77岁，平均49±9.6岁，所有患者在取活检及手术前均未接受放疗或化疗。标本作5μm连续切片备用，细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德公司，P53单克隆抗体、PCNA单克隆抗体购自DAKO公司，免疫组化ABC试剂盒及DAB染色试剂盒购自Vector公司。
1.2　凋亡细胞原位检测法　切片脱蜡入水，3%过氧化氢处理5min，蛋白酶K室温消化5min，蒸馏水洗后加标记缓冲液1min后甩掉；反应液(TdT和DIGdUTP各1μl加入8μl标记缓冲液中)，37℃标记1h；TBS(pH7.5)洗后用封闭液封闭20min；加用封闭液稀释的Anti-DIG-Biotin，37℃反应30min；TBS洗后加SABC室温30min；TBS洗后用DAB显色、封片。以已知凋亡细胞阳性的乳腺癌片作阳性对照，在反应中省略TdT作为阴性对照。
1.3　免疫组化ABC检测法　参照试剂说明书进行。用已知的p53、PCNA片作阳性对照，在反应中省略一抗作为阴性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。
1.4　结果判断方法　P53和PCNA阳性细胞、凋亡细胞(含凋亡小体)的细胞核着棕黄色，计算其标记指数(LI)。LI计算法：先在低倍视野(100×)下选取细胞分布均匀视野，再在高倍视野(400×)下计数1000个细胞中的阳性细胞数，每例计数10个视野，以百分数表示即LI。
1.5　统计学处理　采用t检验、χ2检验和直线相关分析。

2　结　果

2.1　凋亡细胞的检测　在正常宫颈上皮未检测到凋亡细胞，在CIN I/Ⅱ的基底层可检测到少量凋亡细胞，从CIN I/Ⅱ到CINⅢ，凋亡细胞逐渐向上皮的表层扩展，A-LI明显增高(P＜0.05)，A-LI和CIN的病变程度呈正相关，ISCC组的A-LI明显低于CIN组(P＜0.01)(表1)。我们所检测到的凋亡细胞比较典型：细胞变圆或不规则，与邻近细胞的连接消失，呈空晕状，染色质浓缩聚集呈圆形或紧贴核膜边缘成新月状，细胞核碎裂等。
2.2　PCNA　在宫颈癌各级病变中均有表达，从正常宫颈上皮进展到癌的过程中，PCNA-LI逐渐增高(P均＜0.05)，到ISCC增加更显著(P＜0.01)，见表1。

表1　宫颈正常上皮及各级病变中A-LI、PCNA-LI、P53的变化(±s)
 

病理学类型 n A-LI PCNA-LI P53-LI 　P53阳性　
n　　　%
 
正常宫颈 15 0.00±0.00 9.87±1.32 0 0 0
CIN I/Ⅱ 22 0.33±0.09 22.57±2.05 0 0 0
CINⅢ 16 0.69±0.14 31.01±2.04 2.93±1.19 5 31.3
ISCC 52 0.07±0.01 65.92±3.01 20.26±2.91 28 53.8

2.3　P53　在正常宫颈及CIN I/Ⅱ均无表达，ISCC组P53阳性表达率高于CINⅢ，但差异无显著性，P53-LI在两组间差异有显著性(P＜0.01)，见表1。
2.4　P53表达与A-LI及p53-LI和PCNA-LI间的关系　在CINⅢ和ISCC各阶段，P53阳性表达时A-LI低于P53阴性表达时，差异有显著性(表2)。
　　从CINⅢ发展至ISCC，P53-LI和PCNA-LI均呈增高趋势，且在ISCC中，P53和PCNA阳性表达细胞的分布基本一致。P53-LI和PCNA-LI呈直线正相关(r＝0.608，P＜0.01)。

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