een invasive hydatidiform mole and choriocarcinoma were not significantly different(P＞0.05).Conclusions:The high expression of Th2 type cytokines is associated with the development and progress of gestational trophoblastic disease.The transformation of Th1/Th2 may play an important role in early discoverying of trophoblastic tumor,in judging prognoses of patients and in treatment.
Key words Gestational trophoblastic disease;Th1/Th2 type cytokines;Polymerase chain reaction
葡萄胎属于妊娠滋养细胞疾病，具有较高的恶变率［1］。对葡萄胎患者的随访主要靠监测患者的血hGG变化、临床症状及体征，尚无肯定的预测恶变的客观指标。近年的研究发现，Th1/Th2类细胞因子表达的平衡与多种疾病的发生发展相关。肿瘤组织多分泌Th2类细胞因子，机体处于Th2类细胞因子优势状态是肿瘤免疫逃逸的机理之一［2］。我们以IL-2、IFN-γ代表Th1类细胞因子，以IL-4、IL-10、IL-13代表Th2类细胞因子，以β-actin为内参照，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了未恶变的葡萄胎、恶变的葡萄胎及绒癌中细胞因子的表达模式，以探讨不同的细胞因子表达模式与葡萄胎恶变的关系，为临床正确处理提供依据。
1 资料与方法
1.1 资料来源 本研究所用组织标本选自本院、山东省立医院、山东医科大学附属医院、济南市中心医院及济宁医学院附属医院妇科1985年至1995年的住院患者，取下的新鲜组织标本在1h内放入液氮或-80℃冰箱中保存。经随访2年以上证实，葡萄胎未发生恶变12例，葡萄胎发生恶变的标本38例(经手术及临床证实，侵蚀性葡萄胎26例，绒毛膜上皮癌12例)。另外，本研究还包括非葡萄胎来源的绒癌5例。所有病理标本均经两名病理学家复核。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂 细胞因子引物均为美国Verginia大学医学院高斌博士提供，β-actin引物由中国科学院上海植物生化研究所提供，M-MLV逆转录酶购自Gibco公司，TaqDNA聚合酶及4×dNTP均购自上海生物工程公司。
1.2.2 方法
1.2.2.1 提取总RNA的步骤 (1)100mg标本剪碎后加500μl GIT(异硫氰酸胍)变性液，在匀浆器内匀浆。加入50μl 2mol NaOAC(pH4.0)、50μl水饱和酚、100μl氯仿、每步均需混匀，旋涡振荡器混匀10s，冰浴10min；(2)4℃12?000g离心10min，取上清液移入新Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h；(3)4℃12?000g离心10min，弃上清，加入100μlGIT液，吹打使沉淀溶解，加入等体积丙醇，-20℃放置1h；(4)4℃12?000g离心20min，弃上清，用75%乙醇洗1遍，真空抽干，溶于适量无Rnase的去离子水中；(5)用紫外分光光度仪测出A260及A280的值，计算所提总RNA的含量。
1.2.2.2 逆转录(RT)反应 在经DEPC处理的0.5ml Eppendorf管中按表1加入所示试剂。
表1 逆转录(RT)反应体系
试剂名称 用量(μl) 终浓度
总RNA 11
5×RT buffer 4 1×
0.1mol DTT 2 10mmol
M-MLV 1 200U
4×dNTP 1 0.5mmol(每种)
下游引物P2 0.5 10～50pmol
去Rnase水 补至20
快速离心混匀，37℃1h，95℃10min灭活M-MLV，快速离心使蒸汽沉于管底。
1.2.2.3 PCR反应 于20μl RT产物的0.5ml Eppendorf管中继续加入表2所示试剂。
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