以上各步骤间均用TBS振洗3次，每次5分钟，DAB显色3分钟，苏木素复染，氨水返蓝，常规二甲苯，丙酮透明，树酯封片，用TBS替代一抗作空白阴性对照，已知膀胱腺癌阳性片作阳性对照：400倍显微镜随机选择视野(膀胱癌组织)，观察1000个癌细胞，计数阳性染色数量，计算出每张切片PCNA指数。
3 统计学方法
PCNA在各级期中的平均指数用t检验，作Kaplan-Meier生存曲线；累积生存率比较用log-rank时序检验；P<0.05为显著性差异。
结果
PCNA阳性染色为细胞核内染成棕红色，与胞浆界限清晰，在G1，G2，G3级肿瘤及不同临床分期中的分布见表1，G1与G2级PCNA指数无显著差异(P>0.05)；而G3级肿瘤指数显著高于G1与G2级肿瘤(P<0.01)，浸润性癌的PCNA指数高于表浅性癌(P<0.01)。
表1 PCNA在不同期级中的表达指数
分类 病例数 PCNA指数(%) P值
分级
G1 5 2.40±3.28 >0.05
G2 19 9.50±13.40
G3 36 54.75±29.30 <0.01
分期
Ta-T1 38 18.00±23.40
T2-T4 22 52.08±35.12 <0.01
将所有病例平均指数30.4±32.3%分为A组：<30.4；B组：>30.4。A组33例，B组27例，用Kaplan-Meier方法作5年生存率比较，见图1，A组生存率明显高于B组(P<0.01)。
图1 高增殖活性组与低增殖活性组的5年生存率比较
讨论
增殖细胞核抗原PCNA在人类基因组中属高保守基因，定位于第20对染色体。由6个外显子和5个内含子构成，mRNA长度1.3kb，其编码的蛋白为酸性核蛋白，分子量36KD，半衰期20小时。在细胞增殖周期中，PCNA在G1晚期表达幅度增加，至S期表达到达高峰，G2及M期表达下降。Celis［2］等人发现PCNA表达量的变化与DNA合成同步；双向蛋白电泳表明PCNA与细胞周期素Cyclin属同一蛋白，与P21蛋白共同参与构成CyclinD-CDK四聚体复合物，从而参与细胞周期的调控。已经证实PCNA是DNA聚合酶delta的辅助蛋白，具有促进该酶延伸的DNA先导链的能力［1］。因此PCNA/Cyclin在DNA合成与细胞增殖的始动过程中充当重要角色，PCNA直接反映着细胞的增殖活性。
人类膀胱移行细胞癌具有人类恶性肿瘤分化受阻，增殖无限的共性，而且具有生物学行为差异大的特点，因此对于肿瘤进展的判定预测具有重要的临床意义。我们用抗PCNA抗体检测60例移行细胞癌石蜡组织切片，发现随着病理分级的增高，PCNA依次增高；分化差的肿瘤组织G3级显著高于分化较高的G1与G2级肿瘤；浸润性肿瘤(T2-T4)高于表浅性肿瘤(Ta-T1)与Lipponen［3］和Hattori［4］的报告基本一致，而且随着期级的增高，各指数的变异也呈增高趋势。这不能排除不同视野差异的影响，但是同一肿瘤组织不同部位也存在不同的亚克隆瘤细胞，产生不同级别的分化，随着不同期级PCNA指数标准差的递增，从细胞增殖活力方面反映了肿瘤的异质性(heterogeneity)的增加，将所有病例按平均PCNA指数分为高增殖活性与低增殖活性两组，5年累计生存率高增殖活性组低于低增殖活性组(P<0.01)。表明PCNA指数增高的肿瘤具有恶性的生物学行为和不良的临床预后。
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