人白细胞介素

　　人白细胞介素-3(Interleukin-3，hIL-3)是由活化的T细胞产生的一种细胞因子，可刺激造血干细胞的分化和成熟，并且对其他造血因子有协同增强作用。利用PCR技术对hIL-3 cDNA进行体外定点突变并在大肠杆菌中表达［1，2］。近年来国内外对IL-3的研究，天然的hIL-3 cDNA在大肠杆菌中很难获得高效表达。本研究利用PCR技术构建了hIL-3 cDNA突变体，利用已有的表达载体，在大肠杆菌中初步表达了hIL-3 cDNA突变体，获得hIL-3蛋白，同时进行了初步活性研究，对了解hIL-3的结构与功能之间关系奠定了一定的基础。

1　材料与方法
1.1　菌株与质粒　含有人IL-3 cDNA质粒pBVhIL-3 cDNA由本室构建，PUC18，PUC19质粒，大肠杆菌JM103均为本室保存。pSM53质粒，3　185 bp，氨苄青霉素抗性，TAP106 Leu,dio,thi,galam,lac U169 rpsL,supE44 λ｛［int ralⅠ ΔBamHI,cI857,I(ro bio)］｝由第四军医大学生物化学教研室陈苏民教授馈赠。
1.2　主要试剂　各种工具酶，限制性内切酶SmaⅠ，HindⅢ,EcoRⅠ,T4DNA Ligase,Klenow酶，dNTP，地高辛标记试剂盒和NC膜购自Boechriger Mannheim公司。T7测序盒购自Promega公司。α-32p-dATP购自北京亚辉生物技术公司。RPMI1640培养基，谷氨酰胺，小牛血清，购自GIBCO公司。 胰蛋白胨酵母提取物，MTT，GSSG，GSH，兔抗人IL-3多克隆抗体(效价1∶5 000)购自Sigma公司。标准蛋白分子量购自原平生物技术公司。hIL-3细胞依赖株：TF-1细胞购自中科院上海生化研究所。辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(效价1∶200)购自北京中山公司。
1.3　引物　4条引物序列：primer A 22 mer CTCCATGGCTCCCATGACCCAG,primer B 23 mer CGAAGCTTC-TAAAAGAGATCGCGAG,primer M 22 mer CTCCATGGCTCCCGTTACCCAG,primer V 20 mer GTAACCAGATAGAACGTCAG由上海细胞所合成。
1.4　目的基因的扩增
1.4.1　天然hIL-3基因的扩增　primer A与primer B分别为上游和下游引物，模板pBV hIL-3，PCR反应体系为100 μl,95℃变性10 min后加Tag酶0.5 U，然后按94℃，0.5 min；65℃ 0.5 min；72℃ 2 min进行28个循环，最后72℃，10 min。
1.4.2　突变hIL-3 cDNA的扩增　第3位Met突变为Val，以primer M为上游引物，primer B为下游引物。第3位Met和第116位Lys均突变为Val，经过2次PCR，第一次上游引物为primer M,下游引物为primer V,第二次PCR以第一次PCR扩增的产物为上游引物，称之为primer D,primer B为下游引物，其它反应条件同前。
1.5　PCR扩增产物序列分析　PCR扩增产物纯化、回收及与PUC18，PUC19质粒的连接、转化、筛选参照文献［3］。DNA序列分析按照Sanger法进行。Sequenase的使用参照Promega产品说明书。
1.6　hIL-3 cDNA在大肠杆菌中表达及活性测定　将hIL-3 cDNA克隆入表达载体pSM53中，并对重组子进行筛选，鉴定［3］。将含有hIL-3 cDNA阳性重组子转化到大肠杆菌TAP106中培养，诱导表达［3］。对诱导的菌液进行SDS-PAG

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