han that of control(45.0%)with inhibition rate of 38.2%.Conclusion:These results suggested that transduction of antisense RNA of HLA-DR gene into cord blood hematopoietic stem cells can successfully inhibited the expression of HLA-DR antigen.These would provide evidences for the prevention and treatment of transplantation immune reaction in clinic cord blood transplantation.
Key words Hematopoietic stem/progenitor cell Gene transfer Antisense RNA MHC-Ⅱ gene
研究已知供受体HLA不完全相合脐血细胞移植可引起明显的移植免疫反应(免疫排斥反应和移植物抗宿主反应)。国内外研究资料证实造血细胞MHC-Ⅱ类抗原基因(HLA-DR)的成熟表达是引起移植免疫反应的关键所在［1］。研究表明HLA-DR抗原为膜糖蛋白，由α、β链构成，其中组成β链的HLA-DRB基因对HLA-DR抗原的表达和稳定起重要作用［2］。反义RNA可特异阻断目的基因的表达，目前已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗［3］。而运用反义RNA技术下调脐造血细胞HLA-DR的表达的研究少见报道。本文应用逆转录病毒介导的反义RNA导入造血干细胞特异阻抑HLA-DR抗原的表达，为临床进行造血干细胞移植时降低移植免疫反应的发生及克服组织相容性障碍提供新的思路和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 pcDV1质粒含编码人HLA-DRB1(DR-B0101，45.1DR-β008)cDNA的全部序列由美国NIH的Long博士惠赠，逆转录病毒载体pZIP-neoSV(x)由本校免疫教研室王斌教授惠赠，宿主菌JM109由中山大学罗进贤教授提供。
1.1.2 酶和试剂 工具酶购自BRL公司，琼脂糖、低溶点琼脂糖购自Promega公司。rhEPO GM-CSF、IL-3购于GLBCO公司，抗CD34单抗、抗HLA-DR单抗购于DAKO公司，设计引物Ⅰ：5-GAATGGAGATTGGACCTTCC-3，引物Ⅱ：5-CCAAGCCGTTGACGTCTTTT-3(扩增产物为407 bp)，由中科院上海细胞生物所根据DR-B1基因序列设计合成含第二外显子的HLA-DRB1基因特异引物。
1.1.3 仪器 流式细胞仪(FACS)型号EpICS ELITE，美国Coulter公司产品，Mini MACS为德国Miltenyi Biotec公司产品。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒重组体导入包装细胞和病毒上清制备 pZIP-neoSV(x)为带有neo基因的逆转录病毒载体，将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入载体BamHI单酶切点，经扩增、抽提、酶切鉴定［4］。用脂质体法将反义RNA重组体导入到PA317细胞，通过含G418 300 μg/ml培养液选择筛选，经4 w筛选获得抗性克隆，取分泌逆转录病毒的传代培养上清感染NIH3T3细胞，进行病毒滴度的测定［5］。
1.2.2 脐血CD34+细胞的分离、病毒上清感染 脐血(血清型DR1，10)CD34+造血干/祖细胞分离采用免疫磁珠法，先分离单个核细胞，以IMDM调整细胞浓度，洗涤后加磁珠标记的单抗于10℃，孵育15 min，过Mini MACS细胞分离柱，脱离磁场，加压洗脱结合的阳性细胞，取适量细胞作FACS分析纯度。
按文献［6］方法进行。取2×105 ml-1 CD34+细胞种入培养瓶中，加IMDM培养液含20% FCS和EPO(1 U/ml,GLBCO),SCF(50 ng/ml,GLBCO),IL-3(200 U/ml,GLBCO) ，GM-CSF(200 U/ml,GLBCO)37℃,5% CO2 40 h后半量换液，加适量病毒上清和8 μg/ml Polyprene(Sigma，美国)，加含20%FCS IMDM和同上细胞因子培养48 h后，加G418使终浓度达300 μg/ml。48 h后分瓶，补加含G418 300 μg/ml新培养液和同上细
上一页 [1] [2] [3] 下一页
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文