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不同细胞因子基因转导对小鼠B16细胞体内生长及免疫原性的影响 |
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生物公司，51Cr购自Amesham公司。
1.2 逆转录病毒载体的构建 采用PCR方法分别扩增人IL-6及IL-2基因的编码区片段，于两端加入EcoRI及BamHI酶切位点，将两种基因分别插入逆转录病毒载体pLXSN中，构建成含人IL-6及IL-2的逆转录病毒载体。含人IL-6/IL-2融合基因的构建参见文献［1］。
1.3 细胞转染及细胞因子活性测定 B16小鼠黑色素瘤细胞系，引自中国医科院基础所病理研究室，逆病毒介导的基因转染、细胞筛选及细胞因子活性测定等方法详见文献［2，3］。实验所用B16-IL-2、B16-IL-6/IL-2细胞株每天1×106 cells IL-2的表达量均为200 U/ml，B16-IL-6及B16-IL-6/IL-2细胞株IL-6的表达量分别为60 U/ml及40 U/ml。野生型及转染空载体的B16细胞均不表达上述两种细胞因子。
1.4 实验动物 C57BL/6小鼠，二级动物，6～8周龄，体重16～20 g，雌雄不限，购自本院动物中心。
1.5 基因转导对小鼠B16细胞体内生长的影响 C57BL/6小鼠，随机分组，分别收集各实验组细胞制备单细胞悬液并接种于小鼠右侧背部皮下，观察各组小鼠成瘤潜伏期、计算成瘤率及荷瘤存活时间。
1.6 基因转导的B16细胞对机体免疫反应的影响
1.6.1 动物免疫接种 C57BL/6小鼠，随机分为B16、B16-IL-2、B16-IL-6、B16-IL-6/IL-2四个免疫接种组及一个对照组。免疫接种组即收集上述各实验组细胞，3 Gy钴60照射后，分别在各组小鼠腹腔注射接种，1×106/只，1次/w，共计3次。对照组小鼠只注射等量PBS液 。最后一次接种后7 d，每组各处死5只小鼠取脾脏进行免疫学检测，余小鼠分别予以皮下接种不同浓度的B16细胞，观察肿瘤生长情况。
1.6.2 51Cr-4 h释放法测定小鼠脾淋巴细胞LAK及CTL的杀伤活性 方法详见文献［4］。
1.6.3 混合淋巴细胞肿瘤细胞反应(MLTR) 方法参见文献［5］。
1.7 统计学处理 采用一元单方方差分析。
2 结果
2.1 基因转导对B16细胞体内成瘤及生长的影响 皮下接种细胞数为1×104/只浓度时，野生型B16细胞成瘤率为100%，而各基因转导组细胞成瘤潜伏期明显延长，单一基因转导组成瘤率降至60%，融合基因转导组成瘤率降至40%。各组荷瘤存活期均较对照组明显延长。
2.2 基因转导B16细胞对机体免疫反应的影响
2.2.1 脾细胞的LAK和CTL杀伤活性 免疫接种组小鼠脾淋巴细胞，经体外诱导产生的LAK及CTL杀伤活性均较野生型B16细胞接种组提高 ，以B16-IL-6/IL-2免疫组为最高。测定结果见表1。
2.2.2 混合淋巴细胞肿瘤细胞反应 各免疫接种组及对照组脾淋巴细胞单独培养或与经Mit C处理的肿瘤细胞共培养48 h后，取出镜下观察，可见加入相应处理肿瘤细胞的培养孔内，淋巴细胞增殖较为明显，细胞增殖呈克隆状，3H-TdR掺入测定结果见表2。由3H-TdR掺入率比较结果可以看出，当淋巴细胞与瘤细胞共培养时，三个基因转导组表现出增殖活性较B16组及对照组明显提高，提示经基因修饰的瘤细胞用于免疫接种，可使小鼠淋巴细胞处于致敏状态，对于再次相遇的瘤细胞具有识别和反应性增殖的能力。
2.3 免疫接种对再移植瘤生长的影响 免疫接种后的小鼠分别予以皮下接种不同浓度的B16野生型瘤细胞，结果表明，各免疫接种组小鼠均对再次接种的野生型B16细胞产生一定的排斥能力，但随接种肿瘤细胞数目的增加，这种排斥野生型瘤细胞生长的能力逐步减弱直至消失，实验结果见表3。
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