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人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定 |
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、BamHI、EcoRI)、T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR产物纯化系统、fmol DNA测序试剂盒均为美国Promeaga公司产品。DNA分子量标准λDNA/EcoRI+HindⅢ、PBR322/hinfⅠ为华美公司产品，PCR引物由北京赛百胜(美国)生物工程公司合成，32P-dATP为北京亚辉公司产品。
1.3 PCR引物的设计 为了扩增irGH基因5′上游序列，按照文献［4］设计出上游引物(P1)(-484--467 bp):5′-GACTGAATCGTGCTCAC-3′和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5′-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3′。
1.4 irGH基因(-484-+464 bp)片段的扩增 取正常人抗凝外周血，分离出淋巴细胞，用酚抽提法分离DNA，纯化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 μl和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 μl终反应体积中按以下方式进行PCR扩增；95℃，5 min；94℃，1 min，60℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用Wizard PCR产物纯化系统回收。
1.5 irGH(-484-+464 bp)重组质粒的构建 首先取3.0 μg PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 μl反应体系中，25℃水浴水解3 h。然后加入PCR扩增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 μg加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 μl。12℃水浴3 h，将irGH DNA片段两端补齐。然后加入0.1倍体积的3 mmol/L醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，放入-20℃冰箱1 h，取出后4℃ 离心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷冻干燥3 min，加入下列试剂：6 U T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液2 μl、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 μl，补足至20 μl，16℃水浴过夜。然后取DH5a感受态细胞100 μl，加入10 μl连接缓冲液进行转化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行蓝、白斑筛选，即为irGH(-484-+464 bp)重组质粒。
1.6 irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒的构建 取数个白色菌落分别种入含有氨苄青霉素(50 μg/ml)LB培养基的试管中，37℃振荡过夜，采用碱裂解法进行质粒的少量提取，1%琼脂糖凝胶电泳，选出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒，如图1所示用BamHI酶切、鉴定获得正确的克隆，即irGH (-484-+2 bp)质粒。
1.7 irGH基因5′上游核苷酸序列的测定 以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒为模板，用PUC/M13正反向引物行双链双脱氧DNA人工测序，按fmol测序试剂盒说明进行操作。
图1 PGEM7Zf(+)-irGH测序质粒的构建
Fig.1 Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH
2 结果
2.1 PCR扩增irGH基因片段(-484-+464 bp)结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳可见一大约900 bp的特异条带，该条带即为包括irGH 5′上游调控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。
2.2 PGEM7Zf(+)-irGH DNA重组克隆的鉴定 PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端连接后，经蓝、白斑筛选，获得数10个白色菌落。取其中8个白色菌落进行质粒少量提取，琼脂糖电泳分析表明3个质粒为含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后经BamHI酶切分析，如图2所示，质粒1、2切下的片段小(+3-+464 bp)证明为正向连接，而质粒3切下的片段大(-484-+464 bp)为反向连接。然后将切下了小片段的质粒1、2用T4 DNA连接酶连接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒。
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