改变半抗原与载体蛋白的连接桥对提高水杨酸ELISA灵敏度的影响

　　定量检测半抗原的ELISA在植物学研究中已得到广泛应用［1］，但其建立比较困难，因为半抗原与载体蛋白相偶联的人工免疫原所诱导产生的往往是特异性不同的抗体群，制备单克隆抗体时，可以通过筛选得到专一识别半抗原的抗体［2］，而基于多克隆抗体的ELISA往往因多种抗体并存，非特异结合率较高。通过改变包被物中载体蛋白种类可以提高检测灵敏度［3］，但反应体系中仍存在识别连接桥抗体的干扰。能否通过改变连接桥的结构以消除或减少这一类干扰呢?作者对此进行了探索。

1　材料与方法
1.1　化学试剂　4-氨基水杨酸(p-aminosalicylic ac-id,p-ASA)、4-氨基马尿酸(p-aminohippuric acid,p-AHA)、碳化二亚胺(EDC)、5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)购自上海生化试剂采购站；福氏不完全佐剂自制；其它试剂均为分析纯。
1.2　免疫原的合成
1.2.1　SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)的合成　通过重氮化氨基马尿酸法［4］。
1.2.2　SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)的合成　按Bennett的方法［5］。
1.2.3　SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)的合成　用Mannich反应［4］：100 mg BSA溶于2 ml蒸馏水，加入3 mol/L乙酸钠0.67 ml,7.5%(W/V)甲醛1.2 ml，最后加入5-ASA溶液(50 mg溶于2.5 ml 1 mol/L NaOH)，调节pH至8.5，室温下搅拌过夜。将反应物装入透析袋，4℃下先对0.1 mol/L NaHCO3，后对蒸馏水充分透析，冷冻保存。
1.3　包被物的合成
1.3.1　SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA的合成　合成程序与A相同，仅以OVA代替BSA。
1.3.2　SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA和SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成　合成程序与B的相同，以OVA代替BSA合成SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。同时以5-ASA与OVA偶联合成SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。
1.3.3　SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA的合成　合成方法与C的相同，仅以OVA代替BSA。
1.4　抗血清的制备和纯化　参照Weiler的方法，每种免疫原免疫3只新西兰白兔［6］。第4(或5)次免疫后9 d行颈动脉全放血。血样置37℃ 2 h后移入4℃冰箱过夜，4 000 r/min，离心20 min，取上清。用饱和硫酸铵法纯化抗血清。
1.5　SA ELISA操作程序　非竞争性ELISA程序参见Zheng等，用于抗体的产生和效价的检测［7］。竞争性ELISA程序参见张能刚等，用于SA对抗体与包被物结合的抑制率及抗体对SA类似物的交叉反应率的测定［8］。

2　结果
2.1　抗体的产生　4次免疫后，用连接桥相同的包被物的非竞争ELISA检测，发现免疫原A和C诱导产生了高效价的抗体即PAbs(A)和PAbs(C)，其最高效价分别为12 800和25 600(以OD值为1.0时的抗血清稀释倍数表示)。而以戊二醛法合成的免疫原B，经5次免疫也未能检测到抗体的产生。
2.2　连接桥不同的免疫原诱导产生的抗体对SA的特异性　竞争性ELISA检测表明，PAbs(A)对SA的识别能力较低(基于连接桥相同的包被物，SA浓度高达400 nmol/50 μl时，其抑制率仅为31.05%)，而PAbs(C)在用同型连接桥的包被物时已表现出对SA较高识别力，而改用异型连接桥的包被物，其抑制率又有明显提高(表1)。
　　在继续使用异型连接桥包被物的条件下，我们检测了PAbs(C)对13种SA类似物的交叉反应率，结果表明：PAbs(C)除对5-ASA的交叉反应率高达141.2%、对5-磺基水杨酸和4-氨基水杨酸的交叉反应率也较高，分别为15.9%和

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