同时以野生型噬菌体Fuse1为对照，43℃ 30 min后加豚鼠抗M13血清，43℃ 30 min后加HRP-SPA，最后加OPD显色，酶标仪测OD490值。
1.4 阳性噬菌体克隆免疫原性的测定 用筛选出的15个阳性克隆及野生型噬菌体分别免疫Swiss小鼠，每次1012个颗粒，第1次加弗氏佐剂免疫，14 d后用噬菌体颗粒直接腹腔注射，2次免疫后5 d取血清，间接ELISA方法测LPS抗体。用LPS包被，加入待测血清，然后加入兔抗鼠丙种球蛋白，再加入HRP标记的驴抗兔IgG，最后加OPD显色，测OD490值。
1.5 阳性噬菌体克隆DNA序列分析 用Sanger双脱氧末端终止法对可刺激小鼠产生抗LPS抗体的噬菌体克隆进行序列分析，测引物序列为5′HO-TGAATTTTCTGTATGAGG-OH3′，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。
1.6 模拟短肽的固相合成 根据阳性克隆的保守序列在TentaGel S树脂珠上合成固相短肽。方法为固相Fmoc化学合成法，如下：合成反应在8.0×1.6 cm的Polypropylene柱中进行，将3倍克分子浓度的L型Fmoc氨基酸及交联剂BObT及DIC加入溶涨的TentaGel S树脂珠，交联时间为1 h，反应过程均用Ninhydrin test检查其完全程度。Fmoc氨基酸脱保护剂为20％Piperidine/DMF。全部交联完成后用三氟乙酸(TFA) /Phenol /Ethaneditiol/Anisole(94:2:2:2 V/W/V/V)去侧链保护基，用DMF，甲醇，双蒸水及PBS洗涤并保存于含0.02％NaN3的PBS备用。
1.7 合成短肽的抗原性鉴定 以0.2 μg/ml生物素标记1B6抗体与短肽交联树脂珠混合，室温振摇2 h，洗涤后加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温1 h，洗涤后加入底物BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phophate)溶液，立即倒入3.5 cm平皿，呈色反应完全后以1 mol/L HCl终止反应。阳性树脂珠于普通光学显微镜下呈绿色。抗原竞争试验即于加抗体同时加入150 μg/ml的LPS，余同上。
2 结果
2.1 阳性克隆的筛选及免疫原性的测定 从第4轮筛选洗脱物中任选22个克隆以双抗体夹心ELISA测定其抗原性，用PBS调零点，Fuse1为对照。结果如表1所示。
经ELISA法筛选后得到15个阳性噬菌体克隆，将其分别免疫Swiss小鼠，结果2次免疫后有10个克隆产生抗LPS抗体，其中有2个克隆效价较高，结果见图1。
表1 用夹心ELISA法检测噬菌体克隆抗原性
Tab.1 Antigenicity detection of phage clones by sandwich ELISA
No.of phage clone OD490nm No.of phage clone OD490nm
1 0.53 12 0.92
2 0.37 13 0.62
3 0.23 14 0.83
4 0.43 15 0.67
5 0.45 16 0.21
6 1.07 17 0.37
7 0.36 18 0.85
8 1.05 19 0.94
9 1.02 20 0.80
10 0.52 21 1.01
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