一种白细胞共同抗原的鉴定及其对B细胞活化的影响

　　白细胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA)表达于多种白细胞表面，是一大类粘附分子，具有多种功能，与细胞活动密切相关。在免疫应答过程中，LCA参与免疫细胞间的粘附，充当协同刺激分子，与免疫细胞的识别活化、增殖分化、发挥效应有密切关系。LCA表达缺陷，可导致免疫反应异常。由于其作用重要，LCA已受到广泛重视。本实验鉴定了一种LCA 5H12，并对其功能进行了初步分析，为深入研究打下基础。

1　材料与方法
1.1　仪器、材料与试剂　541型流式细胞仪(美国Coulter)；CO2培养箱(美国Shel-Lab)；FITC标记的羊抗鼠IgG，碱酶标记的羊抗鼠IgG，DEAE-Sephadex A50，anti-μ，PHA，SDS，过硫酸铵，HAT，TEMED(均为美国Sigma)；RPMI1640(美国GIBCO)；CNBr活化的Sepharose 4B(瑞典Pharmacia)；3H-TdR(中国原子能研究所)；NP-40，PEG(瑞士Fluka)；硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad)；其它均为国产试剂。各种细胞株由医科院基础所单抗室提供。
1.2　单抗制备　用人活化的B细胞株3D5免疫Balb/c小鼠。在50%PEG(MW：1 450)条件下，将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。融合后的细胞在HAT培养液中培养，杂交瘤细胞经两步进行筛选。先用ELISA法筛选产生高滴度小鼠Ig的阳性孔。再用3D5细胞和人T细胞株Jurkat作靶细胞，经间接免疫荧光染色，用流式细胞仪进行分析，然后对与3D5和Jurkat两种细胞均呈阳性反应孔的细胞作连续3次克隆，最后得到杂交瘤细胞株5H12。接种5H12杂交瘤细胞于Balb/c小鼠腹腔以制备腹水。单克隆抗体5H12的血清型用双向琼脂扩散试验检测。
1.3　人外周血单个核细胞(PBMNC)的制备　方法见文献［1］。
1.4　人外周血T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞和红细胞的分离　方法见文献［1］。
1.5　活化T、B细胞的制备　用24孔板培养细胞，每孔加T细胞悬液2 ml(含2×106个细胞)，T细胞悬液中加PHA至终浓度2 μg/ml，B细胞悬液中加anti-μ至终浓度100 μg/ml，5%CO2培养箱孵育72 h。
1.6　间接免疫荧光试验　一抗用5H12单抗腹水。二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，用流式细胞仪检测［2］。
1.7　流式细胞仪分析　仪器的工作条件为488 nm，每个样品均检测10 000个细胞，检测参数为FALS，L90°LS和LIGFL，用仪器中的计算机分析阳性细胞百分率及荧光强度。
1.8　T、B细胞增殖试验　96孔尖底培养板，每孔置1×105个PBMNC，分加PHA(终浓度2 μg/ml)，anti-μ(终浓度100 μg/ml)和/或5H12单抗腹水(稀释度为1∶1 000.0、1∶500.0、1∶250.0、1∶125.0、1∶62.5)，对照用SP2/0腹水，培养板置37℃、5% CO2培养箱孵育72 h，孵育前16 h加3H-TdR，用细胞收集器收集细胞，液闪计数cpm值，每一条件均设3个平行孔。
1.9　5H12单抗的纯化　先用硫酸铵分级沉淀法，后用DEAE-Sephadex A50离子交换法得到纯化的5H12单抗。
1.10　膜蛋白的提取、纯化和鉴定　按文献［3］提取3D5细胞膜蛋白，按文献［4］用亲和层析法从膜蛋白中纯化5H12抗原，亲和层析柱用的载体为CNBr活化的Sepharose 4B，配基为5H12单抗，纯化抗原先经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再进行Western印迹分析，印迹分析时，一抗用1∶200稀释的5H12单抗腹水，对照为CD8单抗腹水，二抗为1∶3 000稀释的碱酶标记的羊抗鼠IgG［5］。

2　结果
2.1　杂交瘤的筛选与克隆　用3D5和Jurkat作靶细胞，用间接免疫荧光染色法对产生较多小鼠IgG的杂交瘤进行筛选。取两种细胞同时染色(5H12)的细胞，用有限稀释法经连续3次克隆，得5H12杂交瘤。把5H12杂交瘤注射入Balb/c小鼠腹腔制备5H12单抗腹水。琼脂扩散试验表明5H12单抗为IgG2b。

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