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重组抗HBx单链噬菌体的表达 |
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因引物委托中国科学院，上海植物生理研究所合成序列如下：X+：5′-ACACAAGGCCCAGCTGGCCGAGTCAGGAGGAGG-3′；X-：5′-TCAATAGCGGCCGCATGATGGTGATGTATGC -3′。
1.3 构建抗HBx单链抗体组氨酸融合表达载体及其表达，鉴定，参见文献［3］。
1.4 PCR扩增及电泳纯化HBx ScFv/His融合基因片段 以HBxpOPE为模板(10 ng),PCR扩增引物各50 pmol，dNTPs 200 μmol/L,1×PCR Buffer(KCl 50 mmol/L,Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.3,0.1%明胶)，在100 μl的反应体积中加入3 U的Taq DNA聚合酶，于94℃ 45 s，52℃ 15 s，72℃ 45 s(PE 9600)，共30循环，取5 μl PCR产物于琼脂糖电泳鉴定。其余产物经制备型凝胶回收特异性片段(Gel purification Kit,QIAGEN,Germany)于-20℃保存备用。
1.5 抗HBx噬菌体抗体的克隆构建见图1。
1.6 将构建的pCANT-X转化大肠杆菌TG1，于含2%葡萄糖，100 μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养液于30℃振荡培养过夜，提取双链质粒DNA，经酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序鉴定［4］。
1.7 单链噬菌体抗体的融合表达及纯化 阳性克隆1%转种含2%葡萄糖，100 μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养液于30℃振荡培养约3 h(OD600=0.6)，加入总滴度为109的辅助噬菌体M13KO7，并于37℃静置感染15 min。离心收集菌体并重悬于3 ml含50 μg/ml卡那霉素(Kan)，100 μg/ml Amp的LB中37℃培养液过夜。于10 000 r/min，4℃离心收集过夜培养上清，按每ml上清中加入150 μl SA溶液(16% PEG6000，3.3 mol/L NaCl)，4℃2 h静置，于10 000 r/min，4℃沉淀噬菌体，沉淀重悬于100 μl的LB培养液中。
1.8 抗HBx单链噬菌体抗体的ELISA鉴定 取10 μl纯化的噬菌体单链抗体，按10倍稀释至10-6，以M13KO7为对照，和已包被的HBxAg的酶标板(由德国癌症中心提供)室温亲和30 min，以鼠抗噬菌体抗体(mAb,Pharmacia,USA)为一抗，HRP-羊抗鼠IgG(华美生物工程公司)为二抗，检测抗HBx单链噬菌体抗体的亲和活性。
图1 噬菌体单链抗体表达载体的构建
Fig.1 Construction of anti-HBx single chain phage antibody
图2 PCR扩增HBx单链抗体基因的琼脂糖电泳
Fig.2 Electrophoretic analysis of HBx single chain antibody PCR products
Note:1.PCR products of single chain antibody 2.Negative control 3.100bp molecular
2 结果
2.1 PCR扩增HBx单链抗体基因经琼脂糖电泳检maker测约700 bp的阳性扩增产物如图2。
2.2 HBx单链抗体基因克隆于pCANTAB噬菌体表达载体，经BamHI限制性酶切鉴定结果如阳性克隆含有约620 bp的pⅢ基因5′端片段和750 bp的插入片段。
2.3 阳性表达克隆经DNA序列分析结果表明其含有正确整码插入的单链抗体编码基因见图3。
2.4 pCANTAB-HBx表达载体经IPTG诱导，Ni2+亲和纯化产物经Western-blot鉴定结果表明该产物约为29 kD的含有His-Tag的蛋白和单链抗体理论分子量相符，见图4。
2.5 表达的噬菌体融合抗体和HBx抗原亲和的ELISA结果表明经辅助噬菌体诱导产生的重组噬菌体具有和HBx抗原的特异性亲和，见图5。
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