.1 mg/ml Rnase，50℃水浴30 min；再加 1 mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30 min，即获得需要的DNA溶液。取30 μl DNA溶液于1.8%琼脂糖凝胶电泳,细胞凋亡时可出现梯形条带。
1.3 Fas和Fas-L的测定 0.5×106 个HMC-1细胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L单克隆抗体20 μl，加同型非特异性IgG为阴性对照 (Immuno Tech公司),4℃共育30 min；加 FITC-anti-鼠IgM 20 μl, 4℃共育30 min。FCM检测（COULTE，EPICS XL），计数10 000个细胞。
1.4 凋亡细胞群中Fas的测定 中晚期凋亡细胞膜透性可以增加 ，不加Triton-X100的PI可渗入细胞着色。对细胞进行Fas标记后，加0.1%PI染色，在流式细胞仪上进行双标记分析。
1.5 数据处理 t检验。
2 结果
2.1 雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡 在雷公藤红素作用下 HMC-1细胞可出现细胞皱缩，核浓缩，形成凋亡小体的形态改变（图1)。作用24 h,DNA琼脂糖电泳可见梯形条带(图2）。
2.2 HMC-1细胞Fas和Fas-L的表达 HMC-1细胞大小不等，在流式细胞仪上根据前向散射程度可将其分为大、中、小三群，三群细胞分别占37.5％,12.1%,23.7%，三群细胞Fas的阳性率分别为20.0%,37.1%和6.5%；整群细胞表达Fas的阳性率为22.7％，不表达Fas-L 。
图1 HMC-1细胞在雷公藤红素作用下呈凋亡形态改变(HE染色，×400)
Fig.1 Tripterine induced morphological changes characteristic of apoptosis(HE stain,×400)
Note:Condensation of chromatin and apoptotic body formation in HMC-1 cells
图2 雷公藤红素作用24 h HMC-1细胞DNA琼脂糖电泳显示梯形条带
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA from HMC-1 cells treated with tripterine for 24 hours
Note:Marker:657,458,328,289,176 bp
2.3 雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas和Fas-L的影响 在雷公藤红素作用下Fas 阳性率呈先升后降的变化，升高的程度和下降的速率与药物的剂量相关（图3）。 Fas-L 在1.000 μmol/L作用下，0,4,6 h分别为0,3.3%,1.8%。 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 μmol/L 雷公藤红素作用4 h,Fas-L阳性率分别为3.4%,4.0%,5.7%和1.8% 。
2.4 PI染色阳性细胞群中Fas阳性率增高 1.000 μmol/L雷公藤红素作用4 h，PI 染色阳性细胞为21.4%±5.0 % （n＝5）， PI阳性细胞群中Fas阳性率为29.1%±3.9 % ，PI阴性细胞群中Fas阳性率为5.7%±1.2 %，两者相比有显著差异，P＜0.01。
2.5 Fas阳性率与凋亡率变化的关系 HMC-1细胞与1.000 μmol/L雷公藤红素共育，在0，2，4，8 h 同时测定Fas阳性率和细胞凋亡率，分析两者的相关性。发现Fas阳性率自2 h开始呈下降趋势，细胞凋亡率自2 h开始呈上升趋势。至6 h,Fas阳性率仅为2.3%，趋于0，细胞凋亡率继续上升，见图4。
图3 在雷公藤红素作用下流式细胞仪测定HMC-1细胞Fas阳性率的变化
Fig.3 Fas positive rate changes measured on flow cytometry in tripterine treated HMC-1 cells
图4 HMC-1细胞在1 μmol/L雷公藤红素作用下Fas阳性率和凋亡率的变化
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