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用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在PC12细胞中的表达 |
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/L PBS(pH 7.4)洗细胞悬液2次，调细胞数至1×105 ml-1，混匀后取0.1 ml用Cytospin离心涂片，室温自然凉干后于4%多聚甲醛固定10 min，转移至0.01 mol/L PBS(pH 7.4)10 min，经系列酒精脱水，-20℃保存备用。
1.4.3 原位杂交 标本过95%、80%、70%序列乙醇，DEPC处理过后用ddH2O冲洗，然后依次加入0.2 mol/L HCl室温20 min、2×SSC 70℃ 30 min、蛋白酶K混合液(1 μg/ml蛋白酶K、200 mmol/L Tris HCl pH 7.4、20 mmol/L CaCl2)37℃ 15 min，序列乙醇脱水凉干。将杂交液〔50%甲酰胺、100 mmol/L Tris HCl(pH 7.5)、1 mmol/L EDTA、600 mmol/L NaCl、10×Denharts溶液、变性鱼精DNA(10 μg/ml)和tRNA(250 μg/ml)、标记探针(1×105 cpm)〕30 μl滴于标本上，盖上硅化的盖玻片或用新的parafilm于湿盒中37℃保温16～18 h。杂交结束后用2×SSC洗盖玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10 min；换50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10 min；1×SSC室温洗3次，每次10 min，经序列乙醇脱水凉干。
1.4.4 放射自显影 将标本涂核4乳胶，待干后于4℃自显影5～7 d，经D19显影F5定影。流水冲洗后做HE染色，显微镜下镜检计数。
1.5 结果判定及统计学处理 结果判定以计数20个细胞内的银粒数计算平均值，进行t检验。
2 结果
2.1 细胞原位杂交方法的特异性 为确定本方法检测NPY mRNA的特异性，特设立不同对照组包括未加刺激物的空白对照组、RNase A消化组和无探针对照组(见图1)。结果表明，未加任何刺激物的细胞内银粒数较低(4.87±1.45)，而经NGF(50 ng/ml)刺激(24 h)后银粒数显著增高(38.61±7.76)(与对照组比P<0.01，n=20)；后者经RNase A酶(25 μg/ml)处理30 min后发现银粒数(16.88±5.26)显著低于未经RNase A消化组(P<0.01，n=20)；而虽然NGF刺激但未加NPY cDNA探针组则只有少数细胞出现了1～3个乳胶非特异显影形成的银粒(1.41±1.09)。
2.2 NGF剂量与NPY mRNA表达的相关性 PC12细胞经不同剂量NGF刺激24 h后，杂交结果显示：随着剂量增高细胞质中的银粒数相应增加，具有明显的剂量效应关系(r=0.995 0，P<0.01)，见图2。提示NGF具有诱导PC12细胞NPY基因表达的生物学效应。另外亦观察到随着NGF浓度增加，PC12细胞轴突长出的长度增加。
2.3 NGF诱导NPY基因表达的时间效应及Dex对NGF刺激的调节作用 PC12细胞达50%融合度时用NGF(60 ng/ml)和/或Dex(1 μmol/L)处理不同时间，包括长时程(1、2、3、4、5、6 d)和短时程(1、2、4、8、16、32 h)，原位杂交结果显示短时程时，NGF的刺激作用与NPY mRNA表达具有明显的时间效应关系：Dex单独作用不明显，但对NGF的诱导作用具有双相调节效应，即早期(<8 h)具有显著促进作用(P<0.01)，而晚期(>16 h)则抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，见图3。长时程时，NGF的刺激作用仍具有时间效应关系，在第4天后出现“平台”；Dex与NGF联合作用时可下调NGF的诱导作用，而单独Dex则提高NPY mRNA表达水平，但并无显著差异，见图4。
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