张亮林 杨贵贞
中国图书分类号 R392.11 Q516
摘 要 目的：建立NPY mRNA的细胞原位杂交检测方法，并以NGF为诱导因子研究Dex对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中NPY mRNA表达的影响。方法：采用细胞原位杂交方法。结果：NGF具有诱导NPY基因表达的生物学效应且呈剂量效应关系；Dex对NPY mRNA表达具有双相调节效应，即早期(<8 h)可促进NGF的诱导作用，而晚期(>16 h)则具有抑制作用(P<0.01)，但单独Dex对NPY mRNA表达无显著影响。结论：可以用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在细胞中的表达。
关键词 神经肽Y 细胞原位杂交 mRNA
The expression of Neuropeptide Y mRNA in PC12 cell lines detected by in situ hybridization
ZHANG Liang-Lin,YANG Gui-Zhen.
Department of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130021
Abstract Objective:The expression of Neuropeptide Y(NPY) mRNA was detected in PC12.Method: Cellular in situ hybridization.Results:NGF can induce the expression of NPY mRNA in PC12 cells with the relationships of dosage-effect and time-effect.Dexamethasone(Dex) potentiated significantly(P<0.01) the stimulation by NGF at early times(<8 h),but strongly suppressed(P<0.01)it at later times(16 h).The results also appeared that NPY mRNA abundance couldnt be effected by Dex alone.Conclusion:The detection of expression NPY mRNA can use method of cellular in situ hybridization.
Key words Neuropeptide Y In situ hybridization mRNA
NPY具有广泛的生物学活性并参与机体的多种病理生理过程，其在体内表达异常与许多疾病关系密切，但机制未明，因此开展NPY基因表达调控的研究对深入地认识其在疾病发生、发展和转归过程中的作用具有较重要的理论和临床意义。在本室系列工作的基础上［1-4］，本文建立了NPY基因表达的细胞原位杂交检测方法，并初步开展NPY基因的表达调控研究。
1 材料与方法
1.1 材料 PC12细胞(中科院上海细胞所细胞库)。随机引物标记试剂盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物医学公司)，蛋白酶K、RNase A(Sigma公司)，核4乳胶(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去离子甲酰胺、APES和多聚甲醛(华美公司)，小牛血清(杭州四季青)，马血清(解放军农牧大学)，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD显微镜。TA-NPY质粒由本室保存。
1.2 探针制备 常规方法扩增质粒后回收NPY cDNA片段，按随机引物标记试剂盒说明制备35S-NPY cDNA探针，纯化后-20℃保存备用。
1.3 细胞培养 PC12细胞置含5%小牛血清、10%马血清的IMDM中培养后，接种于24孔培养板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同时间后，收集细胞用于标本制备。
1.4 细胞内mRNA原位杂交
1.4.1 载玻片和盖玻片的预处理 载玻片经清洗洁净后于180℃烤4 h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室温凉干后置-20℃保存备用。盖玻片经硅化液浸泡10 min，95%乙醇冲洗，180℃烘烤4 h以上备用。
1.4.2 细胞标本制备 用0.01 mol
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