/Hindlll,pBR322/Hinfl DNA分子量标准购自Gibco-BRL公司，HisTag TM -Sepharose购自Novegen公司，nNOS抗体(p9203多肽合成法制备的抗体)由美国西南医学中心提供，常用化学剂主要为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增及基因重组技术 参考文献［5］。
1.2.2 重组蛋白的纯化 按Novegen公司的产品说明书进行，经HisTag TM -Sepharose纯化的蛋白再用电泳回收法纯化，参考文献［6］。
1.2.3 抗体的制备 将2～4 mg纯化蛋白与完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，接种至新西兰大耳兔足蹼，2 w后加强免疫1次，1 w后追加免疫1次。
1.2.4 Western blot分析 参见文献［4］。在检测肌肉样本中的nNOS蛋白时，将新鲜肌肉置于缓冲液A(10 mmol/L TrisCl,1 mmol/L EDTA/EGTA,0.5 mmol/L PMSF)中匀浆，取匀浆液作常规电泳。Duchenne肌营养不良症(DMD)的肌肉标本由南京市儿童医院神经内科提供，正常肌肉由江苏省肿瘤医院提供，mdx小鼠肌肉样品(已处理)由美国西南医学中心提供。
2 结果
2.1 nNOS(708～881 aa)蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建 用特异性引物1∶5 ′GG-GATCCATATGTCCTTTGAGTACCTAT-3′和引物2∶5′-CGGAATTCTAT CAGAACCTCACTAAGG-3′，以pCMV/nNOS质粒为模板，扩增后得到0.6 kb的特异性片段，将扩增片段用EcoR I和Nde I双酶切，电泳回收后与相同酶酶切的pET28a表达质粒DNA进行连接反应，经筛选得到重组质粒，命名为pET/nNOS 180，其质粒图谱如图1，用不同限制性内切酶进行酶切图谱鉴定，结果证实：插入片段中含有一个Bgl II位点和两个Nco I位点，与已报道序列完全相符，如图2。
图1 pET/nNOS 180重组质粒图谱
Fig.1 Plasmic map of pET/nNOS 180
图2 pET/nNOS 180重组质粒的酶切图谱
Fig.2 Restriction map of pET/nNOS 180 recombinant plasmid
Note:lane M:lambda DNA/Hind III marker;lane A: pET/nNOS 180(Bgl Ⅱ);lane B:pET/nNOS 180(Nco I);lane C:pET/nNOS 180(EcoR I/Nde I)；lane D:pET/28a (EcoR I/Nde I)
2.2 nNOS蛋白片段的表达和纯化 将重组质粒导入BL21宿主菌后，即得到重组工程菌，经IPTG诱导后，可见明显的额外表达带，如图3，重组蛋白约占菌体蛋白的10%～15%，经SDS-PAGE电泳初测分子量为22.000 kD，纯蛋白用质量飞行质谱测得分子量为22.364 kD，与理论计算值(22.117 kD，不考虑蛋白修饰)基本相符。pET28a载体中含有6个连续组氨基酸序列，这样，重组蛋白即可通过金属离子螯合的方法进行快速纯化。我们用Ni离子螯合的方法一次纯化重组蛋白的纯度可达90%以上，如图4。为得到更纯的蛋白作免疫抗原，我们又用电泳回收的方法得到纯度为100%的纯化蛋白(图谱略)［6］。
2.3 nNOS特异性抗体的制备及活性鉴定 通过3次免疫后获得抗血清，用常规间接ELISA法测得在抗体稀释度分别为：1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000时，OD492nm与空白对照的比值(P/N)分别为9.5、8.5、8.1、5.4、2.6和1.6，抗血清的工作浓度初步可定于1∶8 000范围内。
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