中华鳖MHC I 2链基因克隆及序列分析

1　材料与方法
1.1　材料　中华鳖购于北京海淀区中关村。
1.2　方法
1.2.1　基因组DNA提取　采用断颈法取鳖血，参照Sambrook等方法从血细胞中提取基因组DNA［5］。
1.2.2　引物设计　根据Bio Database CD-ROM (GENETYX-CD, 34-1)基因库中人、鼠、鸡和蜥蜴MHC Ia基因序列，在α2链中两个半胱氨酸的外侧设计混合型引物，正引物序列为5′-CAR HNG ATG TAY GGN TGT-3′,反引物序列为5′-YTT NAR CCA YTC NAT RCA-3′，其中N代表A、T、G或C；Y代表T或C；R代表G或A。
1.2.3　PCR　参照Ex Taq PCR试剂盒(日本Takara公司)说明书进行。其中正、反引物各添加100 pmol，模板DNA添加量为 1 μg，PCR反应总体积为 50 μl。PCR程序是首先94 ℃热变性1 min，52 ℃退火1 min，68 ℃延伸 1 min。 所有PCR反应均在PJ 2000型 PCR仪(日本Takara公司)上循环32个周期。
1.2.4　克隆与测序　PCR产物以2% 琼脂糖电泳，采用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司)回收后，与T-easy载体（Promega公司） 连接，转化XL-F′大肠杆菌（Stratagene公司）；再用QIAEX II 试剂盒 (Qiagen公司)提取重组质粒，采用ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit和ABI 377型DNA自动测序仪（均为Perkin Elmer公司产品）测定克隆片段的核苷酸序列。
1.2.5　同源性分析　采用GENETYX 7.3软件在Power Macintosh 9500微机上进行有关分析。

2　结果
2.1　克隆与测序　采用混合型引物进行PCR扩增后得到了一条与预定大小222 bp相同的片段，插入T-easy载体、3次测序结果如图1所示，克隆片段共222 bp, 74个氨基酸，定名为Trsi-BX1。其中，两个半胱氨酸区域内共186 bp, 62个氨基酸。
2.2　序列分析　中华鳖MHC I α2（Trsi-BX1）序列与人、鼠、鸡、蜥蜴、蛙和虹鳟 MHC Ia α2链比较结果如图2所示［2，6-10］，参照人HLA-A2 序列顺序号，Trsi-BX1在96～101、112～122、134～148和159～169区域相对保守。在两个半胱氨酸的内侧区，存在与抗原多肽结合的Thr-143、Lys-146、Trp-147、Tyr-159位点。
2.3　同源性分析　Trsi-BX1与人、鼠、鸡和蜥蜴等MHC Ia同源性比较结果如表1所示，Trsi-BX1与人有46.7%同源性，与鼠47.2%、鸡52.8%、蜥蜴63.9%、蛙41.1%、虹鳟52.6%同源。其中Trsi-BX1与蜥蜴同源性最高。

3　讨论
　　本研究根据动物的MHC Ia α2链序列设计了混合型引物，采用PCR法率先从中华鳖基因组DNA中成功地克隆了MHC Ia α2链(Trsi-BX1)。与X线衍

1　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60
CAGCAGATGT ATGGGTGTGA TCTCTGGGAT GATGGCACCA CCGAGGGGTT TGACCAGTTT
Q　Q　M　Y　G　C　D　L　W　D　D　G　T　T　E　G　F　D　Q　F

上一页  [1] [2]