川崎病患者外周血淋巴细胞凋亡减少的初探

1　材料与方法
1.1　研究对象　收集26例住院KD患者，均符合日本MCLS研究会诊断标准［3］，随机分为两组，阿司匹林(ASP)治疗组和IVIG治疗组(IVIG+ASP)。IVIG组16例，男11例，女5例，年龄8.0个月～6.5岁(平均2.8±1.3岁)，常规ASP治疗组10例，男6例，女4例，年龄6.5个月～5.5岁(平均2.5±1.2岁)，两组患者开始治疗时病程长短、病情轻重均无明显差异。健康对照组20例，男12例，女8例，年龄1.0岁～6.2岁(平均2.6±1.2岁)。
1.2　治疗方法　患者住院时病程为5.0～7.0 d，入院时立即给予治疗。IVIG组于平均病程5.8 d，使用IVIG治疗(2 g/kg,长春生物制品研究所，批号91-13)，同时联合应用ASP 50 mg/(kg。d)，退热后减至10 mg/(kg。d)。ASP组于平均病程6.2 d开始给予ASP治疗，剂量同前。
1.3　细胞分离及培养　两组患儿均在用药前和用药后3.0～5.0 d取肝素抗凝血，常规分离PBMC，调细胞浓度至1×106 ml-1，置24孔培养板，加anti-CD3(终浓度100 μg/ml)，部分加抗IL-6单抗(第四军医大学免疫学教研室，终浓度1∶1 000)，于37℃，5% CO2孵箱分别培养0、12、24、48、72 h。
1.4　凋亡细胞形态学观察　按照文献［4］方法，在荧光显微镜下观察，细胞体积缩小，核固缩，染色质凝固，沿核膜呈点状、新月形、杆状等定为凋亡细胞，计算200个细胞及凋亡细胞百分率。
1.5　DNA梯度观察　根据文献［5］方法略加改良，1×106 ml-1培养细胞中加入低渗性缓冲液(10 mmol/L Tris,1 mmol/l EDTA,0.2% TritonX-100,SIGMA公司)0.5 ml溶解细胞，离心取上清，用饱和酚(pH＞7.8)及氯仿、异戊醇(24∶1)抽提，加无水乙醇，-20℃过夜。70%乙醇洗涤后，RNaseA(20 μg/ml，北京华美公司)去除RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯透照下观察片段DNA梯度，并照相记录。
1.6　IL-6的测定　无菌收集各种条件下PBMC经PHA(终浓度为20 μg/ml)刺激48 h后培养上清，采用双抗体夹心ELISA法检测。IL-6试剂盒为第四军医大学免疫学教研室产品。

2　结果
2.1　凋亡细胞百分率　正常对照组PBMC体外培养不同时间后可见细胞核固缩，呈新月形、杆状等凋亡典型的形态学改变，KD患者出现细胞形态学改变明显延迟。其中培养24、48 h后，KD患者PBMC凋亡百分率与正常对照组相比，结果见表1。
　　经IVIG治疗后，KD患者PBMC体外培养凋亡细胞百分率明显提高，治疗前后差异显著；ASP组治疗前后无差别 ，两组治疗后比较有显著差异，见表2。

表1　KD与正常儿童PBMC的APO发生率比较(±s，%)
Tab.1　Percentage of apoptotic cell of PBMC from KD patients and normal subjects(±s，%)
 

Groups n 0 h 24 h 48 h 72 h
Normal 20 2.01±1.21 21.48±3.41 31.48±4.46 40.74±5.87
KD 30 2.26±1.071) 10.89±3.612) 18.67±5.68 33.15±8.45

Note:compared with normal 1)P＞0.05，2)P＜0.001
表2　治疗前后KD患儿PBMC的APO发生率比较(±s，%)
Tab.2　Percentage of apoptotic cell of PBMC from KD patients before and after different treatment(±s，%)
 

Groups 0 h 24 h 48 h 72 h
　 Before After Before After Before After Before After

上一页  [1] [2]