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人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析 |
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试剂 M-MLV RTase(200 U/μl)，oligo(dT)12-18(0.5 μg/μl)，RNasin(40 U/μl)
,T4 Ligase(1 U/μl)购自GIBCO公司，T7测序kit购自Pharmacia公司，32P-dATP购自北京亚辉公司。限制性内切酶购自华美公司。
1.2 引物设计和合成 设计合成了一对分别位于编码CD59分子cDNA序列的上下两侧引物，中间包含了包括25aa信号肽在内的完整的CD59编码序列384 bp。上游引物5′端加EcoR I酶切位点，下游引物3′端加BamH I酶切位点。PCR引物由本校生化教研室合成。Primer 1:5′-GAATTCATGG
GAATCCAA-GGAGG-3′；Primer 2:5′-GGATCCTTAGGGATGAAGGC-TCCAG-3′。
1.3 细胞总RNA的提取 采用CD59高表达的Jurkat细胞系，参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA，提取物于1.5%的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。
1.4 逆转录反应和PCR扩增 取细胞总RNA 10 μg，分别加oligo(dT)12-18 1 μl或Primer 2 1 μl,5×缓冲液4 μl,0.1 mol/L DTT 2 μl,RNasin 0.25 μl，dNTPs 4 μl，逆转录酶MMLV RTase(200 U/μl)0.2 μl,补充ddH20至20 μl，混匀后37℃反应60 min。分别取逆转录产物5 μl,加入10×Taq酶缓冲液5 μl，dNTPs 2 μl,Primer 1和Primer 2各0.5 μl，MgCl2 2 μl，ddH20 35 μl,95℃变性5 min后加Taq酶0.5 μl，PCR反应程序为93℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸90 s，周期为30个循环，最后72℃延伸10 min。取8 μl PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上行电泳观察结果。扩增片段以pst I酶切进行初步鉴定。
1.5 扩增片段的基因克隆和序列分析 将PCR产物、pUC19和pUC18质粒分别用EcoR I和BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳,回收粘末端的DNA片段，用T4连接酶连接。转化入E.coli JM109后经氨苄青霉素及α-互补筛选，用EcoR I和BamH I酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列分析按Pharmacia公司的T7 Sequence kit说明书进行操作。
2 结果
2.1 Jurkat细胞总RNA的提取 我们选择Jurkat细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA 28、18、5 S三带明显，且28 S＞18 S(图1)。紫外测定表明A260/A280＞1.8，说明抽提的总RNA完整且纯度符合反转录要求。
图1 Jurkat细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图
Fig.1 Total RNA of Jurkat cells
2.2 cDNA第一链的合成及PCR扩增 本实验以合成的CD59下游引物Primer 2为引物合成cDNA第一链，再进行PCR扩增，结果获得396 bp的单一片段。已知CD59 cDNA片段内含有一个pst I酶切位点，用pst I酶切PCR扩增片段后得到70 bp和326 bp片段，初步证明扩增得到的396 bp片段是CD59的cDNA(图2)。
图2 PCR产物酶切鉴定图谱
Fig.2 Digestion map of PCR products
Note:lane 1.DNA markers;lane 2.PCR products digested with pst I;lane 3.PCR product
图3 克隆质粒酶切鉴定图谱
Fig.3 Digestion map of pUC18-CD59
Note:lane 1.λDNA/HindIII markers;lane 2.pUC18-CD59 digested with EcoR I+ BamH I;lane 3.pUC18-CD59 digested with BamH I
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