AAGTCGACATGGTTCGCCTGCCTCTGCAGTGCG-TCCTCTG-3′；下游引物为5′-CATAAGCTTTCATCTCA-GCCGATCCTGGGGACCACAGACA-3′，PCR产物用双脱氧终止法测序正确后，用下游引物中的Hind Ⅲ限制性酶切位点及CD40 cDNA 654 bp处的BamHI酶切位点，用此二酶对PCR产物酶切处理，冻融法回收目的片段。
1.1.2 真核表达载体的处理及反义RNA表达载体的构建 真核表达载体pcDNA3，在多克隆位点处用BamHI、HindⅢ双酶切线性化。将CD40目的片段与pcDNA3线性化载体定向反向连接，重组子即为编码CD40膜内段基因的反义RNA表达载体pcDNA3-CD40。
1.2 细胞培养及pcDNA3-CD40反义RNA的转导 按常规方法进行。
1.3 转导细胞阳性克隆筛选 Balm细胞转导72 h后，更换含G418 800 μg/ml的 DMEM加压培养筛选，10 d后可见抗性细胞生长，改用含200 μg/ml G418的DMEM维持培养2 w，观察细胞生长代谢，收获细胞，做形态、FACS及发光学检测。
1.4 转导细胞的FACS检测 取转导细胞1×106个，用PBS缓冲液洗涤2次，70%乙醇固定过夜，上机前用PBS洗去乙醇，加入0.5 ml PCB(192 ml 0.2 mol/L Na2HPO4+18 ml 0.1 mol/L 柠檬酸，pH 7.8)室温30 min，离心弃上清，加入RNaseA常温下30 min，加入终浓度50 μg/ml PI染细胞总RNA，室温避光20 min，上机检测。
1.5 转导细胞发光学检测 取转导细胞1×106个，MTX终浓度10 μg/ml处理72 h、TNF终浓度10 U/ml处理20 h、ActD终浓度1 μg/ml处理12 h及未作任何处理的Balm细胞各1×106个，均用无血清DMEM洗2次，重悬于1 ml无血清DMEM中，置石英杯中在发光仪中检测各组细胞发光情况。
2 结果
2.1 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的构建
2.1.1 CD40目的基因的获得 经RT-PCR从人扁桃体细胞中获得CD40基因片段，见图1。
图1 CD40 cDNA RT-PCR电泳
Fig.1 Map of CD40 cDNA RT-PCR
Note:A.D.Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ markers B. CD40 cDNA 831 bp (whole length);C.CD40 cDNA 588 bp(intramembrane fragment)
2.1.2 pcDNA3-CD40反义RNA表达载体的获得 pcDNA3经BamHI\,HindⅢ双酶切处理的粘性末端，与上述CD40目的片段，定向反向连接产物即为pcDNA3-CD40反义RNA表达载体。构建模式图及酶切鉴定图，见图2、3。
图2 CD40反义RNA表达载体构建模式图
Fig.2 The construction model of expression vector of CD40 antisense RNA
图3 pcDNA3-CD40反义RNA酶切鉴定
Fig.3 Map of pcDNA3-CD40 antisense RNA by restriction enzymes
Note:A.Lambda DNA HindⅢ marker B.D. pcDNA3 plasmid；C.pcDNA3-CD40 antisense RNA by BamHI/HindⅢ;E. pcDNA3-CD40 recombinant plasmid
2.2 转导细胞凋亡的检测
2.2.1 转导细胞的生长及形态学变化 转导细胞经800 μg/ml G418筛选后，阳性细胞在G418 200 μg/ml维持培养过程中，转导pcDNA3-CD40反义RNA的Balm细胞生长受抑，培养液酸化程度变慢，镜下细胞体积缩小，出现细胞碎块，而转导pcDNA3空载体组的Balm细胞生长旺盛，体积增大，用MTX、TNF、ActD处理的细胞也出现转导pcDNA3-CD40反义RNA组细胞形态改变。
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