而且在肝、肾、脾以及肌肉组织、上皮细胞、肝细胞中也都发现TPO mRNA转录［1］，提示TPO是一种多能分子。我们利用质粒载体介导hTPO经肌肉组织转移，通过基因表达实现TPO对巨核细胞和血小板的促生长作用［2］。鉴于TPO基因注射后，小鼠血小板与巨核系集落形成单位(CFU-MK)二者的增长以及CFU-MK与TPO水平的不一致［3］，提示在机体内诱发了与血小板生成相关的负调节机制。以基因治疗鼠的脾脏组织学变化为线索［4］，本文研究了具有造血调控意义的免疫因子在血小板生成中的变化规律。
1 材料与方法
1.1 动物 Balb/c小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心。
1.2 基因及载体 人TPO cDNA由本中心从肝总RNA中经RT-PCR获得，其功能区片段的原核表达载体pSTPO及真核表达载体均由本中心构建。
1.3 抗TPO血清制备 携带pSTPO质粒的DH5a的大肠杆菌，经IPTG诱导表达后，通过电泳从中分离相应片段。以此片段免疫家兔，获得的抗血清用于基因治疗鼠体内TPO表达水平的检测。
1.4 基因转移 把pcDNA3/hTPO质粒与lipofectin(GIBCO)按5:1(μg:μl)混合后，置室温10 min，以60 μg/只注射到小鼠后肢肌肉组织内。在一定时间内采集血液，分离血浆，用于各种细胞因子或免疫相关分子的检测。鉴于空质粒导入不能提高小鼠血小板计数，也不能使小鼠耐受环磷酰胺的毒性（待发表材料），本试验未设空质粒对照。
1.5 IL-2、TNF-α和IFN-γ的ELISA检测 IL-2和IFN-γ的ELISA kit购自DuPont NEN公司;TNF-α ELISA kit购自邦定生物技术公司。基因治疗鼠和对照鼠的血清按kit要求进行检测。IFN-γ、TNF-α 和IL-2的敏感性分别为3、100和31 pg/ml。按标准曲线求得不同时间的相关因子的浓度。
1.6 组织相容性抗原的检测 鉴于未能得到小鼠组织相容性抗原及其抗体，本文用人HLA-ABC和HLA-DR抗体建立了替代ELISA检测方法，用于判定小鼠血液中游离组织相容性抗原的变化。100 μl血清于4℃过夜包被96孔酶标板，此后依次与抗HLA-ABC和HLA-DR抗体(1:1 000，华美公司)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG各温育1 h，用含2% Tween 20的PBS洗板，四甲基联苯胺盐酸盐显色，2 mol/L 硫酸中止反应。在Bio-Rad Model 450 Microplate读取OD值，以未加酶标抗体的孔为空白对照。
1.7 血小板计数及血浆中TPO浓度的检测 血小板计数按直接计数法进行，TPO按1.6方法检测，抗-TPO血清的工作浓度为1:100。
2 结果
2.1 血浆IFN-γ、TNF-α以及IL-2的动态变化 在TPO基因转移后不到24 h，血浆中此3种细胞因子即出现明显升高。其中，IFN-γ在前72 h内变化幅度较小，于第1周末才陡然增高至对照组小鼠的9～12倍，并持续到4 w以后;TNF-α在转移初期一过性升高，最高达到对照组的120倍，但1 w后回落到对照水平，甚至更低;IL-2在基因治疗后始终处于增高水平，与血浆中TPO的变化基本一致见图1、2。血小板计数变化见文献［2］。
图1 TPO基因导入鼠血液循环中细胞因子的动力学变化
Fig.1 Circulating cytokines dynamics of TPO gene transferred mice
图2 血液中可溶性组织相容性抗原及所表达hTPO的变化
Fig.2 Changes in circulating histocompatibility antigens and the expressed hTPO
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