生物医学公司,rIL-10、8由北京医大马大龙教授惠赠。CD3、CD4、CD8、CD56、HLA-DP单抗购于军事医科院生物制剂发展中心。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC的分离培养 见参考文献［3］。
1.2.2 活化淋巴细胞的诱导 无菌取脐静脉血分离淋巴细胞，用10％FCS-RPMI1640液洗涤后调整浓度为5×106ml-1，加入rIL-2(1 000 U/ml)，放入细胞培养瓶后置37℃、5%CO2条件下培养4 d即为IL-2活化的淋巴细胞。
1.2.3 粘附活性的测定［3］ 培养的HUVEC在24孔板上生长至致密融合的单层后,用10%FCS-RPMI1640液洗涤后做粘附试验：在相应孔中加入37℃预温10 min的对照组脐血淋巴细胞(Umbilical cord blood lymphocyte,UCBL)和IL-2活化的UCBL，2×106ml-1,0.5 ml/孔。每一标本设6个复孔。将培养板置37℃、5%CO2孵箱中孵育30 min后,加入含0.1 mol/L EDTA的RPMI1640液洗涤2次，收集各孔上清液及洗涤液,混合后计数细胞，按下式计算出粘附百分率：
1.2.4 粘附细胞表型测定 粘附试验结束后，用含0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA的RPMI1640液洗下粘附的淋巴细胞，离心，沉淀物涂片。用APAAP桥联酶标法测定细胞表型。
1.2.5 统计学处理 采用t检验。
2 结果
2.1 活化淋巴细胞对HUVEC的粘附作用 3次试验中，rIL-2活化的UCBL粘附HUVEC的能力均明显高于对照组，P＜0.01，见表1。
表1 三次试验中活化淋巴细胞对HUVEC的粘附作用
Tab.1 Adherence of activated lymphocytes to HUVEC
1 2 3 Mean value
Activated UCBL 69.60±1.62 74.52±1.40 56.52±1.91 66.88±9.30
UCBL 29.80±1.70 25.46±1.49 24.54±1.35 26.60±2.81
Note:±s, n=6,P＜0.05
2.2 细胞因子对活化淋巴细胞粘附HUVEC的影响 将rIL-1(10 U/ml)、rIL-8、10(1 μg/ml),TNF-α(250 U/ml)与内皮细胞作用24 h后，测其对IL-2活化UCBL的粘附能力，同时设未经细胞因子刺激的内皮细胞做对照，结果rIL-1、8和rTNF-α明显增强活化UCBL对HUVEC的粘附，而rIL-10对其有抑制作用，(P＜0.05，图1)。
图1 细胞因子对活化淋巴细胞粘附HUVEC的影响
Fig.1 Effect of cytokine(24 h)on adherence of activated lymphocytes to HUVEC
2.3 不同作用时间细胞因子对活化淋巴细胞粘附的影响 与对照组相比，用rIL-1、6(10 U/ml), rIL-2(1 000 U/ml),rIL-8、10(1 μg/ml)处理内皮细胞1 h后，rIL-1、2、8即可明显促进活化UCBL对HUVEC的粘附；处理24 h后，rIL-2、6、8可明显促进粘附，而rIL-10具有明显抑制作用，rIL-1组与对照组无明显差别；处理48 h后，rIL-2、8仍显示较强的促粘附作用，而rIL-1、6、10显示明显的抑制作用；处理72 h后，除rIL-2仍具有较强的促粘附作用外，其他细胞因子均显示出深度的抑制。
2.4 粘附淋巴细胞的表型测定 粘附的活化淋巴细胞中，CD3+、CD8+、CD56+、HLA-DP+细胞均明显高于未刺激的淋巴细胞，P<0.05(表2)。不同的细胞因子作用内皮细胞24 h后，rIL-1、8、rTNF-α增加CD4+细胞的粘附；rIL-8降低CD8+细胞的粘附；rIL-10明显抑制CD3+、CD4+、CD56+细胞的粘附；rIL-1明显抑制HLA-DP+细胞的粘附(P＜0.05)，见表3。
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