1×106细胞/只，1次/w ，连续3 w，最后一次免疫后第4天处死小鼠，无菌制备SPL备用。
1.2.2 融合瘤细胞体内免疫诱导的淋巴细胞特异性增殖反应［3］ 取亲本B16(H4)作为刺激细胞，以100 μg/ml MMC 37℃水浴灭活45 min，以含5%小牛血清的Hank液洗涤细胞3次，调整细胞浓度为1×106ml-1，分别制备不同瘤细胞免疫组小鼠脾细胞(SPL)作为应答细胞，进行再次肿瘤细胞淋巴细胞混合培养(2° MLTC)，调整细胞浓度为5×106ml-1，淋巴细胞和肿瘤细胞均按100 μl/孔加入96孔圆底培养板，刺激细胞与应答细胞比例为1∶5，设B16、EL4及脾细胞对照，37℃，5%CO2培养120 h，终止培养前16 h加入3H-TdR 37 MBq/孔，培养结束后以多头细胞收集仪收集细胞，β-液闪计数仪测量cpm。
1.2.3 特异性淋转诱生的细胞因子的检测［4-6］ 按1.2.2设计2° MLTC实验，取MLTC的上清作为IL-2、IFNγ的检测样品。用IL-2依赖细胞株CTLL-2检测IL-2水平。IFNγ的检测采用VSV-L929系统，以样品诱导L929细胞对VSV攻击的保护作用表示样品中IFNγ效价。TNF检测方法简述如下：将MLTC上清按50 μl/孔加入96孔平底板，对照为不同免疫鼠的单独SPL培养上清，然后每孔加入5×104/50 μl的WEHI-164细胞，再加入氯化锂和放线菌素D(终浓度分别为40 mol/L和2 μg/ml)，常规培养18 h后，每孔加入10 μl Alamar Blue，继续培养18 h，培养结束后在570 nm波长处测OD值，以实验组与对照组OD值的差值标示样品中TNF的活性［6］。
2 结果
2.1 免疫小鼠SPL体外特异性增殖反应 体外混合淋巴细胞肿瘤细胞培养表明，融合瘤细胞B16.B免疫小鼠的SPLs对B16(H4)刺激有明显的增殖反应，而B16(H4)免疫动物的SPLs对B16(H4)刺激的反应水平较低，两者相比，P＜0.01，实验结果还表明融合瘤细胞免疫动物有非特异的免疫功能的提高，因为用同品系(H-2b)的EL4瘤细胞作为刺激细胞时，也可产生一定水平的增殖反应，但显著低于B16(H4)再刺激诱发的增殖反应，P＜0.05。融合瘤免疫组SPLs自发性增殖水平较高也提示该组小鼠SPL在体内已受到较好的预致敏(表1)。
表1 免疫小鼠脾细胞体外特异性增殖反应(n=5)
Tab.1 The specific proliferation response of SPL of immunized mice(n=5)
Responder1) Stimulator
B16(H4) EL4 PBS
B16.B 4 414.4±1 136.12) 2 790.5±675.43) 1 093.0±158.64)
B16(H4) 1 551.5±906.85) 824.2±279.4 397.2±178.7
PBS 397.2±178.7 305.7±71.0 348.7±106.3
Note:date in this table is cpm.1) SPLs from mice immunized with different tumor cells;2)compared with 3)，P＜0.05；2)compared with 4) and 5),P＜0.01
2.2 体外诱生免疫小鼠脾细胞产生细胞因子 融合瘤免疫小鼠脾细胞与亲本瘤细胞共育的MLTC培养上清可检测到明显的IFNγ活性，表现为其上清与L929共育时，能诱导出L929对VSV的抵抗，在样品稀释度为1∶1和1∶4时，OD值为1.12±0.16和0.80±0.08，而亲本B16与PBS免疫组未能测到明显的IFNγ活性，其OD值明显低于前者，P＜0.05(图1)。CTLL-2细胞检测IL-2结果也提示两组间存在差异，表现为实验组上清能够更明显地促进CTLL-2细胞的增殖，OD值明显高于B16(H4)免疫组，P＜0.01(图2)。WEHI-164是TNF敏感的小鼠纤维肉瘤，MLTC上清中若存在TNF活性则将会导致该
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