系统性红斑狼疮患者肿瘤坏死因子与HLA

1　材料与方法
1.1　研究对象　江苏籍汉族SLE患者71例，均符合美国风湿病学会1982 年修订的诊断标准。71例患者按Chubidx标准划分为活动期与非活动期［2］，其中活动期40例，非活动期31例。正常对照组为同一地区的健康随机人群，共69例，年龄性别相当。
1.2　TNFα的检测　用ELISA双抗体夹心法，军事医学科学院生产的TNFα检测试剂盒，按说明操作。
1.3　DNA的制备　采患者和对照组外周血5～10 ml，分离白细胞，改良盐析法抽提基因组DNA［3］。
1.4　PCR扩增　扩增引物由第11届国际组织相容性抗原会议(IHWC)提供，序列为DRB AMPA:CCCC-
ACAGCACGTTTCTTG，AMP-B:CCGCTGCACTGTGAAG-
CTCT，它们引导扩增HLA-DR基因的第二外显子长度为274 bp的核苷酸序列，在DNA自动热循环仪(Perkin Elmer)上进行35个循环，扩增条件参考第11届IHWC的DNA component。
1.5 斑点杂交　3 μl扩增产物点到尼龙膜(Hybond Amersham,英国)上，经变性后烘干，SSO探针的核苷酸序列集中在HLA-DR基因的3个超变区，计有22个， 探针用r-32P-dATP末端标记法进行标记。杂交及洗膜条件均参考第11届IHWC的DNA component。放射自显影1 h至过夜。
1.6　统计学分析　用χ2检验或Fisher精确法分析患者组和对照组DR的基因频率，P值均用Bonferroni法进行矫正，得矫正P值(Pc)，即P值乘以实验系统所检出的基因数，相对危险度(RR)用Woolf法计算。用配对资料的t检验分析患者组和对照组TNFα含量，显著性检验水平为0.05。

2　结果
2.1　SLE患者与正常对照组血清TNFα水平比较　活动期SLE患者血清TNFα水平(482.33±125.36)明显高于非活动期SLE患者(303.07±98.25)和正常对照组(258.13±94.04)，P＜0.01，而非活动期SLE患者和正常对照组血清TNFα水平无明显差异，P＞0.05。
2.2　SLE患者与正常对照组HLA-DR基因频率比较　与正常对照组相比，患者组中DR2基因频率(0.273∶0.131，χ2=10.02，RR=3.33，Pc=0.002 4)显著升高，而DR4频率(0.049:0.159，χ2=9.04，RR=0.24，Pc=0.012 6)则明显降低。
2.3　SLE患者中HLA-DR基因与TNFα含量的关系　将SLE患者分为DR2(+)DR4(-)，DR2(+)DR4(+)，DR2(-)DR4(+)3组，DR2(-)DR4(+)组TNFα含量(523.07±147.25，n=5)显著高于DR2(+)DR4(-)组(312.46±98.15，n=15)及正常对照组(258.13±94.04，n=69),P＜0.05，而DR2(+)DR4(-)组、DR2(+)DR4(+)(398.24±110.42，n=3)与正常对照组间均无显著差异，P＞0.05。

3　讨论
　　江苏汉族SLE患者DR2基因频率明显高于正常对照组，而DR4则明显低于正常对照组，与贺为东和孔繁华等对北方SLE患者的研究结果相似［4，5］，表明中国汉族SLE患者均与HLA-DR2相关，DR4则可能对SLE发病有一定的保护性。
　　TNF基因位于HLA复合体中，处于HLA-B和HLA-C2之间，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNFα和TNFβ。TNF基因在MHC中的位置使人们推测，TNF基因在MHC连锁的疾病特别是自身免疫性疾病中起某种作用［6］。与白种人SLE相关的单倍型HLA-A1B8C4AQ0C4B1DR3中带有TNF Nco I 5.5 kb的片段［7］，具有HLA-A1B8DR3单倍型的细胞培养上清液中TNFα的活性比不带这种单倍型的要高，SLE异常扩增的T细胞亚群能检出高水平的TNFα mRNA，SLE患者血清TNF受体水平明显高于正常对照，且随病情活动而升高，二者呈正相关。在(NZB×N

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