出现核浓缩或核碎裂为细胞凋亡标准)计数每份标本出现凋亡的细胞数〔每份标本至少计数200个细胞，计算凋亡率(%)〕。
1.2 DNA片段化率的测定 用二苯胺测定方法［4］，用Bio-Rad450型比色仪在590 nm波长下比色测定每份标本DNA片段化率(%)。
1.3 DNA凝胶电泳 取实验后Mcs悬液，4℃离心(500 r/min)PBS洗涤后，加入等体积裂解缓冲液(5 mmol/L Tris HCl,pH8.0,100 mmol/L NaCl,100 mmol/L EDTA,1%SDS,200 μg/ml蛋白酶K)充分混匀，37℃孵育12 h后按传统酚-氯仿-异戊醇抽提DNA方法［5］，收集Mcs的DNA，在1.6%凝胶中160 mV电泳2 h后，观察DNA条带分布情况。Mcs细胞凋亡率、Mcs DNA片段化率用±s(%)表示，用配对t检验及直线相关进行统计学处理。
2 结果
形态学观察表明抗Fas抗体能诱导Mcs凋亡，细胞凋亡率随抗Fas抗体剂增加而增高，Mcs的DNA片段化定量分析显示Mcs DNA 片段化率与抗Fas抗体浓度呈直线正相关(Y=10.20+4.6X,r=0.972,P＜0.001)(表1)；Mcs DNA电泳分析表明抗Fas抗体可致Mcs的DNA呈不同程度“梯形”改变，而对照组Mcs的DNA断裂不甚明显(图1)。
表1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡DNA片段化率和凋亡细胞计数的定量分析
Tab.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quantiative analysis
Group Anto-Fas Ab(μg/ml) DNA fragmentation(%) Mcs apopotosis(%)
Control 0 4.82±1.56 5.62±2.30
A 2 25.2±4.241) 24.56±1.951)
B 5 34.52±5.651) 31.78±2.851)
C 10 54.45±4.821) 51.24±3.251)
Note:1) Compared with control,P＜0.01
图1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡的DNA凝胶电泳分析
Fig.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quality analysis
3 讨论
细胞凋亡是多细胞机体的重要生理、病理过程，主要表现为细胞核的皱缩、染色质浓聚、碎裂，DNA片段化。这种现象贯穿于肾脏正常生理及疾病发生的全过程［1］。文献［2］报告Fas-FasL系统可通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导细胞毒性作用和对免疫应答的调节作用而参与机体的细胞凋亡过程。Wong等报告Fas抗原不仅存在于淋巴细胞、巨噬细胞表面，也存在于肝、肺实质细胞表面［6］。本实验通过用FasL的协同剂——抗Fas抗体与Mcs共同培养16 h，从细胞形态学角度观察到抗Fas抗体导致Mcs核浓缩、核碎裂，与正常对照组比较存在明显差异(P＜0.01),从Mcs DNA裂解片段化的定性分析可见受刺激后Mcs的DNA呈“梯形”分布，Mcs的DNA片段化的定量分析也有相同结果。这些结果充分证实抗Fas抗体对Mcs具有致凋亡作用，间接证实了Mcs膜表面存在着Fas抗原、与文献［6］报告的抗Fas抗体可诱导鼠肾小球系膜细胞凋亡的结果相似。Los等认为Fas抗原存在于细胞表面的特定区域，一旦被FasL或类似物激活，可通过白细胞介素转化酶或Ced-3基因产物转移凋亡信息入细胞内，产生类似于原癌基因或化学药物的物质作用于细胞DNA，或者导致类似CTL反应作用于细胞DNA，使其裂解而致细胞凋亡［7］。可见细胞凋亡不仅受细胞本身的Ced-3、Bcl-2基因控制也受Fas-FasL系统的调控。
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