实验性消化道溃疡上皮淋巴细胞毒活性的变化

1　材料与方法
1.1　动物　C57BL/6雄性鼠，6～8周龄，来自本校实验动物部。
1.2　实验性消化道溃疡模型——水浸限制刺激　将小鼠限制在盖有孔的50 ml离心管中，加水至小鼠胸骨处，将离心管置于22～23℃水浴箱中轻微震荡8 h后取出。剖开腹腔，摘出全胃，观察到胃粘膜出现浅表性溃疡为阳性。经统计，用该方法所诱导的小鼠应激性溃疡成功率达95%以上［6］。
1.3　IEL及脾淋巴细胞的分离　IEL的提取方法参照文献［5］。取回盲部至胃幽门部的全部小肠，冲洗干净后翻转肠，剪成小段，放入装有45 ml Hank′s液的离心管中，37℃150 r/min震荡45 min后，离心弃上清，用不同浓度的Percoll淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离IEL。同时常规方法提取脾细胞。
1.4　乳酸脱氢酶释放法［7］检测IEL及脾细胞杀伤活性　用下列公式计算杀伤活性：

1.5　统计学检测方法　根据Students′t-test判断实验组与对照组的显著性差异。

2　　结果
2.1　IEL细胞毒活性的变化　分别分离水浸限制刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠IEL，用乳酸脱氢酶释放法检测其对靶细胞YAC-1的杀伤活性。结果显示在刺激后第2天，IEL杀伤活性为52.3%，明显高于正常对照组(27.6%)，P＜0.01。以后逐渐下降，刺激后第9天实验组IEL杀伤活性基本恢复至正常水平(图1)。
 

图1　水浸限制刺激对C57BL/6鼠IEL数量和杀伤活性的影响
Fig.1 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of IEL in C57BL/6 mice(n=6)
Note:P＜0.01

2.2　脾淋巴细胞杀伤活性的变化　分别分离刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠脾淋巴细胞，去除红细胞和巨噬细胞后用同样方法检测其杀伤活性。发现脾淋巴细胞杀伤活性在刺激后略有增强，第3天增至最强，但无统计学意义。以后下降，刺激后第5天脾淋巴细胞杀伤活性(14.6%)降至正常水平以下，与对照组(26.1%)比较显示有意义的差异(P＜0.05)(图2)。
 

图2　水浸限制刺激对C57BL/6鼠脾淋巴细胞数量和杀伤活性的影响
Fig.2 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of spleen lympocyte cells in C57BL/6 mice(n=6)
Note:*P＜0.05 **P＜0.01

2.3　IEL和脾淋巴细胞数量的变化　在检测IEL和脾淋巴细胞杀伤活性的同时，分别计数了IEL和脾淋巴细胞数，其结果如图1和图2。水浸限制刺激后第2天IEL总数降至最低，为2.60×106±0.53×106，以后逐渐回升，刺激后第9天IEL总数恢复正常水平。而脾淋巴细胞总数在刺激后第6天降到最低(0.74×107±0.07×107)，第9天尚未恢复到正常水平。

3　讨论
　　肠上皮淋巴细胞作为存在于肠上皮间的数量庞大的T淋巴细胞，其在消化道局部免疫系统中所起的生理作用值得研究。有报道水浸限制刺激降低Peyer′s板和肠系膜淋巴细胞总数，并改变这些免疫器官的T细胞构成［8］。我们也曾利用该刺激诱发小鼠消化道溃疡，检测小鼠IEL细胞数及其分化亚群的动态变化。发现水浸限制刺激一过性降低小鼠IEL总数，分化群中αβIEL下降幅度大于γδIEL；Thy1+IEL下降幅度大于Thy1-IEL(待发表)。提示水浸限制刺激对消化道粘膜免疫的影响的确存在。众所周知，肠粘膜以其庞大的总面积抵抗着外来抗原及其它微生物对人体的侵袭，并不断新陈代谢更换上皮细胞。依据IEL分布位置及数量，可推测其在抗感染免疫及免疫监视中意义重大［4］。杀伤活性作为机体抵

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