从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段

　　　近年来，我们用体外致敏法结合噬菌体表面呈现技术构建了人源抗大肠癌单链抗体库［1］，用固相抗原递减法经3轮筛选得到90个阳性克隆。在噬菌体fUSE5载体DNA中的单链抗体(Single-chain variable fragments,scFv)基因的插入片段大小约为500和220　bp不等。挑选A405　nm值最好的3个克隆经免疫组化鉴定，它们均与大肠癌组织反应。测序结果显示，其中两个克隆仅为重链可变区(VH)片段，而第3个更短，仅为轻链可变区第三互补区(The third complementarity-determining region,CDR3)。现报道如下。
　　
1　材料与方法
1.1　噬菌体抗体克隆的筛选和扩增　用Hb3抗体亲和层析柱纯化的大肠癌抗原CA-Hb3包板的间接ELISA筛出90个阳性克隆，其中A405nm值最好的EL5D、EL6D和Ca123个克隆。挑取单菌落接种于含40 μg/ml四环素的LB培基中，37℃，振摇过夜，离心保留上清(含噬菌体颗粒，抗体片段表达于噬菌体衣壳蛋白Ⅲ的氨基端［2］)。取2μl上清作模板用PCR检查抗体基因在噬菌体DNA中插入片段大小，PCR引物及条件参照文献［3］。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物大小。
1.2　噬菌体抗体克隆测序模板的制备　将上述含EL5D、EL6D和Ca12噬菌体抗体克隆的15 ml上清分别用PEG/NaCl沉淀纯化，溶于1ml H2O中，PEG/NaCl再沉淀一次，溶于0.5ml H2O中,酚、氯仿分别抽提一次，最后用酒精沉淀噬菌体单链DNA(ssDNA)。ssDNA溶于10μl H2O中,其中2μl用于测A260nm和A280nm值，其余用于测序。
1.3　噬菌体抗体克隆测序　测序引物为5′HO-GAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCT-OH 3′［3,4］，插入片段距离该引物尚有25个核苷酸。采用全自动荧光测序仪(美国Perkin Elmer公司，377型)进行测序并从基因库的BLASTN中进行同源性分析［5］。
1.4　噬菌体抗体克隆结合抗原功能的鉴定　免疫组化方法鉴定3个噬菌体抗体克隆，一抗为阳性噬菌体克隆，二抗为HRP-抗M13酶结合物。癌细胞株的免疫组化：癌细胞株为人大肠癌(HRT-18、HT-29、Hce-8693、SW620)、人鼻咽癌(HNE1)、人白血病(HL-60、K562)。大肠癌组织的免疫组化：按常规处理，封片观察结果。

2　结果
2.1　抗体片段的插入大小　EL5D、EL6D和Ca12 3个克隆经PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后显示EL5D仅有约220 bp，后两者为500 bp(图1)。

图1　PCR扩增的噬菌体抗体克隆在载体DNA中插入片段大小
Fig.1 Inserts of antibody genes in vector DNA of fUSE5 analyzed by PCR

2.2　抗体片段的核苷酸序列分析　上述3个抗体克隆的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图2，其中EL6D和Ca12两个克隆全长384个核苷酸，均为重链可变区序列，属VH5-D-JH4,两者差别仅在第177位A(EL6D)换成C(Ca12)，由此氨基酸残基由Gln(Q)变为His(H)；EL5D全长105个核苷酸，属Vκ中Jκ1序列，仅含有κ轻链部分FR3-CDR3-FR4结构。3个基因的5′端序列为CTATT CTCACTCGGCCGACGTGGCC，3′端为GGGGCCGCT GGGGCCGAAACT GTTGAA，系载体fUSE5 DNA在插入片段两端的序列(斜体)及限制性内切酶SfiI的识别位点(下划线)，说明所测插入片段序列完整。
2.3　抗体片段结合抗原的活性　细胞免疫组化结果显示，VH结构的EL6D和Ca12可结合人大肠癌细胞，不与人白血病细胞和人宫颈癌细胞反应，但尚与人鼻咽癌反应。大肠癌免疫组化结果则显示，EL5D、EL6D和Ca12均可与Hb3阳性的大肠癌组织反应，且与Hb3的结合部位一致，均为大肠癌细胞的胞浆、胞膜以及腺腔内分泌物。

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