丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨

1　材料与方法
1.1　质粒　重组质粒pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-
HCV3分别含有HCV结构区基因片段1693、1695和1697，基因型为OkamotoⅡ型，5.1kb。哺乳细胞表达质粒pCD-SRα1，含有SV40早期启动子和HTLV-I型末端重复RU-5片段，3.4 kb。
1.2　HCV抗原、同位素　合成肽CP9、CP10由中国科学院上海生物研究所合成。基因重组抗原C、E1、E2由北京中国药品生物制品检定所汪兴太、张庶民博士提供和惠赠。3H-TdR，放射活性为32 μCi/毫克分子，购于中国科学院上海核技术开发公司。
1.3　动物　Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，浙江医科大学实验动物中心提供。
1.4　方法　
1.4.1　实验分组　随机将小鼠分为实验组（注射重组体pCD-HCVs）和对照组（注射pCD-SRα1）。
1.4.2　免疫方法　实验组于小鼠四肢肌肉多点注射重组体pCD-HCVs 100 μg/(只*次)，间隔2 w免疫1次，共3次，对照组以同样方法注射pCD-SRα1。
1.4.3　血清抗体检测　无菌断尾取血，分离血清，用样本稀释液将血清稀释10倍或若干倍数，用ELISA法检测血清抗体［3］。
1.4.4　脾细胞增殖反应
1.4.4.1　脾细胞制备［4］　将脾细胞（2×106 ml-1）于96孔细胞培养板加200μl/孔，随后加入10 μl(0.6 μg)HCV抗原，每个实验组3个复孔，同时设阴性对照（加脾细胞不加抗原），培养6 d；pCD-SRα1免疫鼠脾细胞增殖反应，方法同实验组。
1.4.4.2　脾细胞增殖反应检测　脾细胞培养6 d后，加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18 h，收集细胞，在液闪仪上检测cpm，以刺激指数（SI）表示脾细胞对HCV抗原的增殖反应，SI≥2.1为阳性［5］。

SI=(实验组cpm-细胞对照组cpm)/(细胞对照组cpm)

1.4.5　PBMC的增殖反应　于小鼠腋窝无菌取血加入肝素抗凝管，将注射同种重组体的3～4只小鼠血混为1份标本，常规分离PBMC，调细胞浓度为1×106 ml-1，后续步骤同脾细胞增殖反应。
1.5　统计　采用t检验、F检验、SNK检验对实验资料进行统计学处理。

2　结果
2.1　重组体pCD-HCVs免疫鼠产生抗体水平比较　由表1可见，3种不同重组体2次或3次免疫小鼠后，均可诱导小鼠产生特异性抗体。用SNK方法对不同组间抗体水平检验，差异无显著性意义(P＞0.05)。

表1　不同pCD-HCVs重组体免疫小鼠抗体水平比较
Tab.1 Comparison of antibody level in mice inoculated with different pCD-HCVs recombinant
 

No. pCD-HCV1 pCD-HCV2 pCD-HCV3
Second
inoculation Third
inoculation Second
inoculation Third
inoculation Second
inoculation Third
inoculation
1 0.301 0.604 0.299 0.711 0.313 0.692
2 0.404 0.742 0.343 0.742 0.346 0.743
3 0.362 0.592 0.378 0.608 0.374 0.784
4 0.394 0.684 0.421 0.649 0.287 0.607
5 0.418 0.761 0.442 0.769 0.292 0.614
6 0.298 0.607 0.364 0.708 0.468 0.804
x±s 0.363

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