T细胞识别人多发性骨髓瘤细胞XG

1　材料与方法
1.1　细胞株与抗体　人多发性骨髓瘤细胞株XG-7(本室建立)［5］以10%小牛血清完全培养基维持，并加入1ng/ml rhIL-6作为XG-7细胞生长因子。抗TCRαβ，γδ，TiVA(Vγ9),BB3(Vδ2)购自法国Immunotech,抗HSP60、70单抗购自Sigma。
1.2　细胞膜蛋白组分制备　XG-7细胞109悬于冰浴的细胞膜蛋白抽提液(1%TritonX-100,150 mmol NaCl,10ml Tris,1 mmol PMSF)，12 000 r/min离心10min，收集上清上柱层析(HPLC Soures Q15柱，Waters 1×30 cm，Shimadza sd-6a)，以0.5mol NaCl溶液梯度洗脱，每组分收集1 ml,在4℃透析过夜，定量备用。
1.3　细胞培养　γδT细胞扩增培养按文献［4］进行，并以磁珠负选择法去除其中的αβT和NK细胞。为探索建立以HSP70多肽激发扩增PBMC中γδT细胞方法，选择健康正常人和急性B淋巴性白血病患者各5名获取PBMC，在24孔板内5×105 ml-1 PBMC加入9 μg/ml HSP70多肽，7d后，加入IL-2 500U/ml激发获取γδT细胞。
1.4　细胞膜组分的γδT细胞刺激效应分析　取纯化后(γδT细胞90%以上)的γδT细胞0.1 ml(4×105ml-1)加入膜蛋白组分9μg/ml，48 h后加入10 U/ml IL-2,1μCi/孔3H-TdR。18 h后收集测定cpm值，以不加膜蛋白孔为阴性对照，加辐照过的XG-7细胞作为阳性对照。
1.5　FACS分析　按本室常规方法进行。
1.6　Western blotting　常规电泳分离细胞膜组分，转膜，以含5%脱脂奶粉的PBST溶液在温室封闭3 h，然后加入第一抗体(1∶1 000)4℃振荡过夜，洗涤后加入第二抗体，在室温反应2 h；洗涤后加入化学发光试剂作自显影。

2　结果
2.1　γδT细胞扩增及纯化　运用本文所述方法，我们获得了表型为TCRVγ9-Vδ2亚型，阳性率占96%以上的γδT细胞(表1)。

表1　γδT细胞纯化前后百分率变化
Tab.1 Changes of γδT cell percentage before and after purification by magnetic beads selecting
 

　 Before purification(%) After purification(%)
TCRγδ 53.9 95.9
TCRαβ 38.6 3.5
TCRVδ2 nd 91.4
TCRVγ9 nd 87.5
CD56 17.1 3.2

Note:The data are the results of one sample.nd:not done;The culture cells were purificated with magnetic separation method,then the cell phenotype was analyzed by flow cytometry
2.2　细胞膜组分对γδT细胞的刺激效应　为证实XG-7细胞膜蛋白各组分对γδT细胞的刺激效应，将各组分膜蛋白刺激γδT细胞、以3H-TdR掺入法观察γδT细胞的增殖程度

上一页  [1] [2] [3] 下一页