基因的质粒pRIT-5及大肠杆菌JM107由中科院生物物理所赠送。
1.2 质粒DNA提取［9］ 基本上按Aandrew Mountain等的方法提取。
1.3 转化方法 pRIT-5通过细菌感受态转化至枯草杆菌R25菌株中［10］，在10 μg/ml氯霉素的平皿上选择转化体，再通过原生质体转化至地衣芽孢杆菌NM105中［11］。因NM105菌无细胞感受态，所以必须经过原生质体转化，才能使质粒DNA进入菌体内。经氯霉素抗药性筛选，得到阳性转化体。
1.4 转化子的筛选鉴定 琼脂糖凝胶电泳和Cla I、Bcl I两种限制性内切酶消化反应按McDonel1等方法进行［12］。
1.5 A蛋白基因表达量与培养时间关系的观察 将鉴定后得到的携带pRIT-5质粒的阳性转化子、R25和NM105按相应时间进行培养，时间分别为2、4、6、8、12、16 h。每一管内为10 ml LB培养液［12］，氯霉素为10 μg/ml，分别取相应菌株的一个单菌落加入试管中，37℃振荡培养，经饱和硫酸铵沉淀，得到培养液上清中的可溶性蛋白。
1.6 R25培养过程中中性蛋白酶抑制剂EDTA对表达量的影响 在培养高峰细菌达到对数后期时，加EDTA浓度至1 mmol/L，继续培养20 min，对照组不加，然后提取胞外可溶性蛋白。
1.7 应用低酶活性培养基与LB培养基分别培养的NM105表达量观察［11］ 培养方法是接菌在低酶活性培养基普通CH/S培养基培养过夜，转接至无磷CH/S培养基中培养6 h，然后再经硫酸铵沉淀，透析得到胞外可溶性蛋白，留做ELISA检测。
1.8 ELISA测A蛋白基因的表达量及免疫活性 参见文献［13］。
1.9 胞外蛋白酶活性测定 参见文献［14］。
2 结果
2.1 携带外源基因——A蛋白基因的质粒的筛选与鉴定 携带A蛋白基因的质粒pRIT-5是一个大肠杆菌和枯草杆菌中的穿梭质粒，具有氨苄(Ap)抗性和氯霉素(Cm)抗性，但在不同的菌种中显示不同的抗性，在枯草杆菌及地衣芽孢杆菌中只显示Cm抗性。我们利用这一特性进行携带外源基因阳性转化子筛选，从得到的阳性转化子中提取质粒DNA，选择A蛋白基因上所带单酶切位点的Bcl I酶和双酶切位点的Cla I酶，进行酶切反应，与原大肠杆菌JM107中所提的质粒pRIT-5进行对照，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，酶切图谱一致证明质粒稳定，如图1所示。
图1 由JM107、R25和NM105分别提取质粒DNA酶切电泳图谱
Fig.1 The electrophoretic pattern of plasmid DNA digested by restrictive enzyme in JM107,R25 and NM105
Note:1.control zone of plasmid DNA;2～4.a line zone of plasmid DNA digested by restrictive enzyme (Bcl I) in JM107,R25 and NM105;5～7.two line zone plasmid DNA digested by restrictive enzyme (Cla I) in JM107,R25 and NM105
2.2 A蛋白基因表达量与培养时间关系曲线 将按不同时间培养得到的胞外可溶性蛋白经ELISA进行定性定量检测A蛋白，其关系如图2所示。
2.3 A蛋白基因表达量与胞外蛋白酶活性的关系 由于R25菌株是碱性蛋白酶缺失的突变菌株，所以在实验过程中观察A蛋白基因表达量与胞外蛋白酶的关系，还需限制中性蛋白酶的活性。实验组中加EDTA后培养得到的胞外可溶性蛋白与对照组经ELISA检测，其结果是，实验组使胞外蛋白酶活性降低50%，A蛋白表达量较对照组提高46%。
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