与方法
1.1 CY12.14单克隆抗体的亚型鉴定 抗Saporin的单克隆抗体细胞株CY12.14（Prof.Ferrini实验室）培养至5×106细胞/0.5 ml注射BALB/C小鼠产生腹水，应用protein A Sepharose (Kit)分离CY12.14单抗，CY12.14抗体经SDS-PAGE 10％胶电泳(图略)，最后用Bio-Red公司抗体作亚型分析(Kit，catalog number 172-2055)。
1.2 CY12.14单抗的免疫印迹实验(Western blot) 将Saporin 用 SDS-PAGE 电泳样品缓冲液稀释 10 μg/ml（100℃×5 min）与 14 C- Lucin标记标准分子量分别上12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取出电泳胶，转移至Immobilon膜（12 mA，40 min），将印迹膜取出，切割 14 C- Lucin标准分子量膜带，以PBS 0.02%叠氮钠保存。样品膜带以TTBS（20 mmol/L Tris, pH 7.4, 0.05% Tween 20,0.14 mol/L NaCl）和2.3％脱脂奶室温振荡处理1～2 h，洗涤后样品膜带加CY12.14单抗，另外取一条样品膜带加非相关性抗体作为阴性对照，室温内振荡1 h，再经TTBS 2.3％脱脂奶洗涤4次后，分别加 125 I-兔抗鼠IgG（大约2×105cpm/ml）振荡培养1 h后洗涤干燥，在暗盒内与Immobilon-p-teflon胶片自动曝光(图1)。
图1 CY12.14单克隆抗体与对应抗原皂角毒的免疫印迹分析
Fig.1 Immunoblot analysis of the saporin which use the monoclonal antibody(CY12/14) to detect
Note:1. 14 C-Lucin protein molecular weight marker. 2. 1 μg/ml Saporin. 3. 0.1 μg/ml Saporin. 4. 10 μg/ml Saporin. 5. 5 μg/ml Sporin. A.The immobilon straps(2,3,4) incubate with CY12.14 and add the second reagent 125 I-RAM IgG，show blot(29 kD) in film. B. The immobilon strap(5) incubate with no specific antibody and add the second reagent 125 I-RAM IgG.strap(5) shows insensible blot(29 kD) in film
1.3 EGF-R单克隆抗体（EQ75）免疫组化分析 方法参考文献［3］。
1.4 EQ75抗肿瘤细胞株的免疫荧光测定［4］ 将若
干管肿瘤细胞株A549、A431、SPC A1 （5×104/管）分别加入50 μl EQ75单抗细胞株培养上清及加入非相关性抗体作为对照组。方法参见本文1.6.1。
1.5 杂交-杂交瘤细胞株的制备［5］ CY12.14经1～20 γ/ml的8-杂氮鸟嘌呤RPMI1640培养液培养筛选出HRPT 酶缺失的 CY12.14杂交瘤细胞株。将EQ75（HRPT＋） 1×107杂交瘤细胞株用PBS洗涤，在1 mol/L iodoacetamide(Sigma公司) 10 ml PBS 保存（4℃）30 min，PBS洗涤，然后与5×107CY12.14（HRPT-）杂交瘤细胞株混合，用RPMI1640无血清培养液洗涤，按常规融合方法，融合细胞在37℃ CO2 孵箱内培养，48 h后用HAT RPMI1640 10％FCS选择培养基。
1.6 二次杂交瘤（抗EGF-R×CY12.14）筛选和鉴定 筛选融合细胞的96孔板中，发现近20％孔生长有单个簇型细胞，然后将此类孔上清液分两步进行筛选。
1.6.1 将上清50 μl加入5×104A431/管中，4℃30 min，洗涤后加羊抗鼠IgG-FITC，4℃30 min，洗涤后流式细胞仪定量荧光分析（图2）。
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