肌酐酶法测定的两点法

3　实验和结果
3.1　去除肌酸干扰的能力　选择肌酐含量为495 μmol/L的样品一份,分别加入肌酸34,67,101,134 μmol/L用本法测定,结果分别为497.6,495.8,492.7,489.1 μmol/L,说明通过第一步反应至少能去除134 μmol/L的肌酸。
3.2　反应动力学曲线　选择不同浓度的样品按测定方法中的参数将样品和试剂Ⅰ混匀，37℃水浴300秒，然后加入试剂Ⅱ，立即于Beckman DU-640分光光度计自动记录动力学曲线，见图1。说明样品浓度在2740 μmol/L(31 mg/dl)以下时120～300秒间呈线性。在此时间内可以用两点法测定。

Figure 1　Reaction curve of creatinine
图1　反应动力学曲线

3.3　线性范围　按NCCLS(EP6-P)的评价方案,选择低值(97 μmol/L)和高值(2 749 μmol/L)样品各一份等量混匀产生中间值,再分别将中间值和低值,中间值和高值等量混匀,共产生5个不同值,用三种分析仪分别用两点法从低值到高值,然后从高值到低值测定,求得均值为Y,以理论值为X,进行回归分析，三种仪器的回归方程如下,Hitachi 7170:Y=0.9912X+9.55,r=0.9999；Beckman CX5:Y=1.0799X-32.56，r=0.998；Ciba-Coning:Y=0.997X-39.4，r=0.9987。均有很宽的线性范围。
3.4　精密度　按NCCLS(EP5-T2)的评价方法，选择88.7和752.3 μmol/L的样品各一份，用Beckman DU68分光光度计每天上下午双份测定，测10天，结果：批内CV 2.73%和0.71%；批间CV 4.43%和2.93%；总CV 4.92%和2.73%。三种仪器二个样品的批内CV：Hitachi 7170为0.38和0.34%；Beckman ΔCX5为1.44和1.31%以及Ciba-Coring为0.58和0.43%。
3.5　回收率　选择肌酐含量82.7 μmol/L的混合血清一份，分别加入221，442和884 μmol/L用本法测定，回收率在99.66%～100.9%。
3.6　方法比较　按NCCLS(EP9-P)的评价方案，选择含量在35～2 655 μmol/L间的临床样品40份，分别用本法(Y)和BM公司的试剂盒(X)测定，结果X=411.1 μmol/L,Y=410.2 μmol/L,Y=0.973X+10.33 μmol/L,r=0.9995。二者有良好相关。
3.7　参考值测定　选择健康体检样品275份(其中男183份，女92份)，年龄在23～60岁。列入统计者均无肾病史，肾功能检验均正常。在Beckman CX5分析仪上用本法测定,结果,男子±s为98.4±18.9 μmol/L,范围为60.6～136.2 μmol/L,女子±s为77.8±16.5 μmol/L,范围为44.8～110.8 μmol/L。

4　讨论
4.1　据报告，肌酐酶法测定有四条反应途径[1～5]，综合于图2。我们选择比色测定是因为其灵敏度较高，线性范围宽，几种工具酶的稳定性较好。

Figure 2　Reaction principle for enzymatic measurement of creatinine
图2　各种酶法测定肌酐的反应原理

4.2　酶法测定肌酐的特异性远优于Jaffe氏法，血清中的内源性肌酸可用二步反应清除，我们在反应体系中加入亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶以消除Trinder反应中的胆红素和维生素C的干扰。

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