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gp130分子在树突状细胞上表达及其意义 |
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抗体B-T2由本室研制［3］。淋巴细胞分层液购自上海试剂二厂。RPMI1640为美国Gibco公司产品。
1.2 树突状细胞（DC）的体外培养 正常健康人外周血经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液进行常规密度梯度离心取单个核细胞(PBMC)，洗涤后，以含10%FCS的RPMI1640调整细胞浓度至3.5×106 ml－1，加6孔板中（2 ml/孔），5%CO2、37℃培养3 h，吸去非粘附细胞，获得贴壁单核细胞，然后将贴壁单核细胞分成4个组，分别加入培养液。第1组中加入DC的培养液I（GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml）；第2组中加入DC的培养液II（GM-CSF 100 ng/ml,IL-4 50 ng/ml和TNFα 20 ng/ml）；第3组中加入DC的培养液I和抗CD40单抗（100 ng/ml）；第4组中加入DC的培养液II和抗CD40单抗（100 ng/ml）。然后将这4组细胞置于37℃, 5%CO2的培养箱中进行培养。在培养4 d和7 d后，分别收取这4组细胞，进行DC的表型分析和gp130分子表达的分析。
1.3 细胞表型分析 将细胞调整浓度为5×106ml－1，加入eppendorf离心管，每管100 μl。离心后吸去上清，加入50 μl单抗，单抗的标记浓度为20 μg/ml，置于4℃,30 min，用含1%FCS的PBS洗涤2遍，加入荧光标记二抗，4℃置于暗处30 min，洗涤2遍，用流式细胞仪（Coulter，核医学生物技术重点实验室）检测表型。
2 结果
2.1 gp130分子在单核细胞上的表达 从外周血获取的PBMC，贴壁培养3 h后，去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞。部分单核细胞经胰酶处理，悬浮后，立即用FCS中和胰酶活性，离心洗涤后，测定其细胞膜上的gp130分子（见图1A），gp130分子在单核细胞上呈弱表达，仅为15.9%。
2.2 gp130分子在DC上的表达 以GM-CSF和IL-4培养单核细胞使其分化成为DC。培养7 d后，DC上的gp130分子表达增加（见图1B）。目前已知GM-CSF和IL-4是DC的主要增殖分化因子，TNFα是DC的成熟因子之一。近有文献报道，通过CD40配体（CD40L）激发DC前体细胞上的CD40分子也可促使其向DC分化、增殖和成熟［4］。本室制备的刺激型抗CD40单抗，可取代CD40L，起着激发CD40分子的作用。根据上述这些因子的作用特点，我们进一步将单核细胞置于上述因子的不同组合之下，分别经过4 d和7 d的培养，动态观察在诱导DC过程中，DC上CD1a、CD14、CD80和HLA-DR表达的情况，同时也观察gp130分子表达的变化，其结果见表1和表2。在GM-CSF和IL-4的作用下，随着培养时间的延长，DC上的gp130分子的表达在增加，在成熟因子TNFα作用下，gp130分子的表达可进一步增加。在刺激型抗CD40单抗的作用下，DC的数量有了明显的增加，约增加28.9%，而gp130分子的表达也显著增加，但抗CD40单抗和TNFα合用后，gp130分子的表达未见比单用时有明显的增加。
图1 单核细胞和树突状细胞上gp130分子的表达
Fig.1 Expression of gp130 molecule on monocytes and dendritic cells
Note：A.Monocytes;B.Dendritic cells
表1 培养 4 d 的DC上gp130和DC相关分子的表达(%)
Tab.1 Expression of gp130 molecule and DC-associated molecule on DC after 4 days culture(%)
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