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重组狂犬病毒在原核细胞中的表达 |
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检测IL-2活性 采用小鼠免疫法检测表达产物的抗原性。
2 结果
2.1 目的基因PCR引物设计与扩增 设计两对PCR特异性引物，含有酶切位点及启动子的IL-2引物。含有酶切位点及终止子的狂犬病毒N蛋白基因引物。扩增后得到IL-2 (0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)基因片段。结果见图1、图2。
图1 构建IL-2和N蛋白的表达载体
Fig.1 Construction of human IL-2 and NP expressing clone
图2 IL-2和狂犬病毒N蛋白扩增产物
Fig.2 Matters of IL-2 and rabies virus nucleoprotein gene by PCR
Note:1. 0.4 kD IL-2 gene;2. 1.4 kD rabies virus nucleoprotein gene;3.λDNA HindⅢ marker
2.2 目的基因构建 将分别获得的IL-2和狂犬病毒N蛋白基因分别连接于T载体中克隆，经特异性酶切后，于PBV220表达载体中构建，得到表达载体(PBIRB vetor)，本表达载体有SD序列和PRPL启动子及T1T2终止子，在ECORI和BamHI两酶切位点之间有IL-2 RB基因，构建图见图1。构建后基因纯化后鉴定结果见图3。
图3 重组基因鉴定
Fig.3 The recombinant gene were identified
Note:1.λ DNA HindⅢ marker; 2. 0.4 kD IL-2 gene and 1.4 kD rabies virus nucleoprotein; 3. 1.8 kD recombinant gene
2.3 目的基因的表达产物鉴定 目的基因于工程菌中转化后，获得产物经IL-2单抗检测结果见表1。表1结果可见，重组产物具有IL-2活性。表达产物免疫小鼠后，以狂犬病毒标准毒株(CVS)攻击小鼠，小鼠有一定保护力。攻毒途径：脑内0.03 ml，含30个LD50病毒。
表1 重组基因表达产物酶联免疫吸附试验结果
Tab.1 The experssion matters of recombinant gene of enzyme linked immnosorbeat assay
Groups
(IL-2 absorb value (OD，±s) Negtive
1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32
1 0.235±0.04 0.249±0.05 0.276±0.05 0.172±0.04 0.130±0.01 0.119±0.04
2 0.231±0.03 0.262±0.08 0.312±0.04 0.191±0.07 0.090±0.01 0.101±0.03
3 0.256±0.05 0.200±0.04 0.270±0.05 0.190±0.04 0.070±0.02 0.006±0.01
4 0.224±0.03 0.200±0.04 0.254±0.01 0.212±0.06 0.061±0.03 0.009±0.02
3 讨论
以狂犬病毒及IL-2基因文库设计2对具有特异性酶切位点引物，经PCR扩增后，得到两条特异性基因片段，分别为IL-2(0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)。两基因于T载体中克隆后，顺利得到重组子。
选用PBV220表达载体，正向插入目的基因，获得表达型特异基因载体，该载体除基因自身的启动子和终止子外，还具有PRPL强启动子和T1T2终止子。于工程菌中表达得到较理想效果。
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