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实验性消化道溃疡肠上皮内淋巴细胞体外转化能力与IFN 分泌活性的变化 |
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EL存在于消化道粘膜层，在诱导局部粘膜对入侵抗原产生免疫应答，及时清除被病原微生物感染的上皮细胞；以及在参与对细胞表面表达的抗原成份产生免疫应答［4，5］等方面有重要意义。
消化道溃疡作为临床常见病和多发病。就其成因而言，导致精神紧张和植物神经紊乱的外界刺激均与溃疡的发生与发展有密切关系。本文通过水浸限制刺激方法建立了消化道溃疡实验动物模型，通过对模型鼠IEL体外转化能力和淋巴因子γ干扰素(interferon-γ，IFNγ)分泌活性的动态检测，进一步证实外界刺激因素对消化道粘膜免疫产生的影响，更好地解释IEL在消化道局部粘膜中的生理意义。
1 材料与方法
1.1 动物 C57BL/6雄性鼠，6～8周，来自本校实验动物部。
1.2 实验性消化道溃疡动物模型水浸限制刺激法参考文献［6］并加以改进。将小鼠限制在盖有孔的50ml离心管中，加水至小鼠胸骨处，将离心管置于22～23℃水浴箱中轻微震荡8h后取出。剖开腹腔，摘出全胃，观察到胃粘膜出现浅表性溃疡为阳性。经统计用该方法所诱导的小鼠应激性溃疡成功率达95%以上。
1.3 IEL的分离［7］ 取回盲部至胃幽门部的全部小肠，冲洗干净后翻转肠，剪成小段，放入装有45ml含5%FCS的Hanks液的离心管中，37℃，100r/min震荡45min后，离心弃上清，用不同浓度的Percoll淋巴细胞分离液(Sigma)分离IEL。
1.4 IEL体外转化能力的检测［8］ 用含10%FCS和5μg/ml ConA的RPMI1640培养液调整IEL浓度为1×106/ml，加IEL细胞悬液到96孔培养板中，每孔200μl，每份标本设6个平行孔，37℃5%CO2孵箱培养56h后，每孔取上清100μl移至Eppendorf管中，-70℃保存，用于细胞因子分泌活性的检测。然后每孔加［3H］TdR37kBq，继续培养18 h。收集细胞到玻璃纤维膜上(每孔一个膜)，70℃烤箱烘干后，将其放入含有6 ml液体闪烁液的闪烁瓶中，暗室中静置4h以上，用液体闪烁计数仪(美国Backman LHS3801型)测定每瓶闪烁液中所含同位素放射性cpm值，用下列公式计算IEL的刺激指数：刺激指数=(实验组cpm值-对照组cpm值)/对照组cpm值
1.5 用ELISA方法检测IEL淋巴因子IFNγ分泌活性［9］ 用抗鼠IFNγ MoAb(Sigma)包被96孔板，封闭液用含20%小牛血清(FCS)和0.1%Tween20的PBS缓冲液，封闭2h后，将-70℃保存的培养上清倍比稀释，每个稀释度设4个平行孔，37℃孵育2h后，加生物素标记的抗鼠IFNγ MoAb(Sigma)孵育2h，最后用碱性磷酸酶及其作用底物显色20min，酶联免疫检测仪测OD405值，通过IFNγ标准曲线计算培养上清中IFNγ含量。
1.6 统计学检测方法 根据Students t-test判断实验组与对照组的显著性差异。
2 结果
2.1 IEL体外转化能力的变化 分别分离水浸限制刺激后1，2，3，4，6 d的C57BL/6鼠IEL，用〔3H〕TdR同位素掺入法检测IEL体外转化能力。结果显示：与正常未给予任何刺激 对照组相比，实验组IEL体外转化能力呈上升趋势。刺激指数在刺激后第3天达到最高值，为1.15，增殖百分率为114.5%，以后逐渐下降，刺激后第6天基本恢复正常水平(表1，图1)。
表1 3H-TdR掺入法测定有丝分裂原诱导的小鼠IEL体外转化反应(±s)
应激后时间(d) cpm
对照 1727±456*
1 1879±394
2 2385±421*
3 3706±372**
4 3045±298**
6 1982±446
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