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反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖 |
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纯。
1.4 细胞株：人结肠腺癌HT29细胞系本实验室保存。
2.方法[8]
2.1 质粒DNA的制备：细菌生长在含氨苄青霉素的LB培养基中。在氯霉素存在下
扩增。采取碱法裂解，用聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA。
2.2 质粒DNA的限制性酶切和凝胶电泳：参考文献[8]。
2.3 DNA片段回收：利用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段。
2.4 外源DNA和质粒载体的连接：(1) 线状质粒DNA的去磷酸化参照文献[8]。(2)
连接反应依次按载体DNA∶外源DNA=1∶1、1∶3或3∶1摩尔比设计连接反应。在
T4 DNA ligase作用下于4℃中反应过夜，取1μl转化大肠杆菌感受态细胞。
2.5 含重组质粒的细菌菌落的鉴定：随机挑取一些独立的转化菌落进行小规模培
养，制备质粒DNA，然后用限制酶进行消化，通过凝胶电泳进行分析。确定单一插
入片段的重组子，在插入片段的非中央位置选取单酶切位点，结合载体上的酶切位
点，限制酶切分析，判断插入片段的方向。
2.6 重组质粒转染HT29细胞[8,9]：(1) 细胞培养：HT29细胞培养在含10%小牛血清
的Mc Coy′5A培养基中，于37℃含5% 孵箱培养。使细胞分散充分，散布均匀。
(2) 按参考文献[7]制备磷酸钙DNA共沉淀物。(3) 转染细胞：用吸液管将混合液吹打
1次，转移至细胞培养皿内培养液中，培养6h后，吸出培养液和沉淀物用培养液将细
胞洗2次。加入含10% DMSO的37℃培养液，放回孵箱，作用2.5min。吸出含DMSO
的培养液，洗细胞2次，然后换为含G418(400mg/L)的培养基培养。每2～4d换液1次。
(4) 克隆细胞的扩大培养：细胞克隆长出后，让其在含G418培养基中继续生长2周。
吸取少量胰酶对准克隆消化适当时间，吸取细胞转入24孔培养板中，在G418培养基
中继续培养。
2.7 细胞总体RNA的制备及Northern blot:(1) RNA的制备详见文献[10]。(2) 用常规方
法进行Northern blot。
2.8 DNA探针的制备及预杂交、杂交和放射自显影：详见文献[11]。
2.9 细胞生长曲线：用胰酶消化对数生长期的HeLa细胞及其转染细胞，计数，接种
于小方瓶培养。每24h，平行取3份消化， 细胞计数仪计数，求平均值， 绘制细胞生
长曲线。
2.10 ３H-TdR参入试验[12]：用胰酶消化对数期生长的HT29及其转染细胞，计数，
接种，24h后，加入３H-TdR(1mCi/L)于培养液脉冲标记6h。弃去培养液，收集细胞，
制备样品。利用抽滤器将细胞样品裂解液点到硝酸纤维素滤膜上，三氯乙酸冲洗，
干燥。在Beckman LS-9000型液体闪烁计数器中测量。记录样品脉冲数/分(CPM)。
2.11 流式细胞光度术(FCM)：收集对数期生长的转染细胞及其对照细胞，PBS洗1
次，将细胞快速吹散于70%冷酒精中，4℃固定24h。离心，洗涤，加入RNase A,
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