反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

邢录洲 王永潮
(北京师范大学生物系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875)

　　摘 要 用DNA重组技术将人类cyclin B1基因的全长cDNA，反向插入到真核表达
载体pXJ41-neo的BamH1位点，得到cyclin B1基因的反义RNA表达载体pAS-B1。利用
DNA磷酸钙共沉淀方法，将pAS-B1转染进HT29细胞。在含有G418的培养基中，挑
选出独立的细胞克隆。利用cyclin B1 cDNA作探针，Northern blot杂交鉴定出一株内源
性cyclin B1 mRNA受到抑制的细胞株HTB1。比较HTB1与对照细胞HT29发现，cyclin
B1的反义RNA明显抑制HT29细胞的增殖，细胞内3H-TdR参入量减少。流式细胞光度
术分析，处于G1期细胞比率的升高与S期、G2+M期细胞数量的下降都十分显著。
　　关键词 DNA重组 反义RNA 周期蛋白B1 基因转染

　　周期蛋白(cyclin)是Evans等[1]在1983年研究海胆(sea urchin)早期胚胎同步化细胞
分裂过程中发现的。它在间期合成，含量持续积累升高，在有丝分裂向后期转换时，
突然降解，G1期又开始合成，由此得名cyclin。首先在海蛤(clam)中鉴定出两种cyclin
蛋白：cyclin A和cyclin B[2,3]，它们的序列存在差异。由于cyclin B是M期促进因子
(M-phase promoting factor, MPF)[4]的组成成分，它引起了人们的极大关注。MPF主
要是由催化亚基p34cdc2和调节亚基cyclin B组成的激酶复合体(cyclin B/cdc2)[5]。真核
细胞M期的诱导由MPF来完成。cyclin B1是Hunter等[6]在1989年从HeLa细胞cDNA文
库中分离获得，它是在人类体细胞中发现的第一个cyclin。
　　反义RNA(antisense RNA)是一类天然的广泛存在于生物体内的基因调控分子。这
类小分子RNA不能编码蛋白质，主要通过碱基互补方式，与特定的mRNA形成双链
RNA杂交体调控基因表达。现在，随着天然反义RNA的普遍发现，以及对它们的结
构特征、作用机理和功能效应的深入研究，启发了人们利用反义RNA抑制特定基因
表达的特征，发展了多项反义RNA技术，特别是利用基因重组技术，在适宜的启动
子和转录终止子之间反向插入一段靶基因，构建反义RNA表达载体，将其转染进细
胞，在体内表达出反义RNA，从而对靶基因表达进行抑制，这是技术上的一大进步。
反义RNA技术在研究基因负调控作用机理中显示巨大潜力，同时为肿瘤等疾病的基
因治疗带来了希望。


材料和方法

1.材料
　1.1 菌种：大肠杆菌菌株HB101，为本实验室保存。
　1.2 质粒：pCycB1由Tony Hunter教授(The Salk Institute for Biological Studies, San
Diego, California)惠赠，其内部含有人类cyclin B1基因的全长cDNA,1.45kb,克隆于
质粒载体pGEM-4的BamH I酶切位点。pXJ41-neo[7]由王跃博士(国立新加坡大学分
子及细胞生物学研究所)惠赠。1.3 试剂：限制性内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连
接酶、同位素标记试剂盒prime-a-gene Labelling system购自Promega公司；G418、琼
脂糖、低熔点琼脂糖、DEPC、HEPES、MOPS、gunidinium isothiocyanate购自Gibco
公司；sodium lauryl sarcocinate、sodium citrate购自Sigma公司；2-mercaptoethanol,
formamid、Formaldehyde购自Fluka公司；α-32P-dCTP(3 000 Ci/mmol, 10Ci/L)购自北
京亚辉公司；3H-TdR(1Ci/L)购自中国原子能研究所(北京)； 其他试剂为国产分析

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