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反义周期蛋白B1基因转染HT29细胞后若干细胞增殖调控相关基因表达的变化 |
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c基因的长为2.2kb的cDNA，克隆于pSP65的EcoR Ⅰ位点；(6) pP53由本实验室保
存，其内部含有人类p53基因的长为1.7kb的cDNA，克隆于pUC18的EcoR Ⅰ-Hind Ⅲ
位点；(7) pRb由本实验室保存，其内部含有人类Rb基因的长为0.9kb的cDNA，克隆于
载体的EcoR Ⅰ位点；(8) pTGF-β1由本实验室保存，其内部含有人类TGF-β1基因的
长为2.0kb的cDNA， 克隆于pBR322的EcoR Ⅰ位点。
1.3 试剂：限制性内切酶、同位素标记试剂盒prime-a-gene labelling system (Promega)；
琼脂糖、低熔点琼脂糖、DEPC、HEPES、MOPS、gunidinium isothiocyanate (Gibco);
sodium lauryl sarcocinate, sodium citrate (Sigma); 2-mercaptoethanol, formamide, formal-
dehyde (Fluka); (α-32P) dCTP (3 000 Ci/mmol, 10mCi/ml) (北京亚辉公司)；其他试剂为
国产分析纯。
1.4 细胞株：人结肠腺癌HT29细胞为本实验室保存，HTB1本室用cyclin B1基因转染
的HT29细胞系[4]。
2.方法[5]
2.1 基因片段的制备：将各种质粒分别转化感受态细胞，制备质粒DNA，用相应的
限制性内切酶消化，用低熔点琼脂糖凝胶回收目的基因片段。
2.2 细胞总体RNA的制备：本实验采用异硫氰酸胍\|酚一步法，参照Chomczynski[5]的
方法略有改动。当RNA样品中18S，28S rRNA完整，OD260/OD280大于1.85时用于实
验。样品保存于-70℃。1 OD260=40mg RNA/L。(CSB buffer: 42mmol/L sodium citrate,
0.83% N-lauryl sarcosine, 1% 2-mercaptoethanol)
2.3 点杂交(dot blot): 硝酸纤维素膜浸泡于RNase-free水中湿润，转入20×SSC中于
室温浸泡40min。RNA样品与dot Mix(formamide 1 000 μl, 37% formaldehyde 350μl,
20×SSC 100μl)按1∶2.9混合，68℃温浴15min, 冰水中冷却。利用多孔过滤加样器
Minifold Ⅱ(Schleicher 和 Schuell) 将RNA样品点样于硝酸纤维素膜上。室温自然晾干，
真空80℃烤膜2h。
2.4 DNA探针的制备：本实验采用Promega公司的产品prime-a-gene labeling system,
按照操作指南进行。以特定基因的DNA片段(25ng)作模板，(α-32p) dCTP和3种未标
记的dATP, dGTP, dTTP在klenow fragment作用下，合成出高比活度双链DNA探针。
2.5 预杂交、杂交及放射自显影：将样品膜浸入5×SSC湿润后，装入杂交袋中，按
小于0.2ml/cm2的用量加入预杂交液(5×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 200mg/L denatured
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