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反义周期蛋白B1基因转染HT29细胞后若干细胞增殖调控相关基因表达的变化 |
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邢录洲 王永潮
(北京师范大学细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875)
摘 要 用基因重组技术将插入有反义周期蛋白B1(cyclin B1)基因pXJ41-neo质粒，
转染人结肠腺癌HT29，获得了HTB1细胞株。HTB1细胞显示出cyclin B1 mRNA明显
的表达抑制。为了探讨HTB1细胞生长变慢和它的增殖相关基因表达之间的关系，我
们用异硫氰酸胍-酚一步法提取HTB1和HT29细胞的总RNA，并用一些有关的基因探
针进行杂交实验。其结果表明：c-myc和CDK4在HTB1中的表达低于在HT29中的表
达；而另一方面，p53、Rb、TGF β和cyclin D3在HTB1细胞中的表达高于对照组。
而cdc2基因表达二者维持相似水平。根据研究结果我们发现，转染有反义cyclin B1
基因的HTB1细胞在一组正、负调节基因的协同作用下，导致细胞周期运转的变化。
关键词 分子杂交 反义周期蛋白B1基因 癌基因 抑癌基因 周期蛋白依赖性激酶
在正常细胞的生长、增殖和分化过程中，正、负调节机制使细胞维持一种动态平
衡，在这种动态平衡条件下，细胞按照有序的、相互制约的规律进行着生理活动。几
十年来，在很多科学工作者的不懈努力下，发现和阐明了细胞增殖调控的一些事件和
环节，正趋向揭示增殖调控机理的本质。一方面是鉴定出转化病毒基因组中癌基因的
同源物(原癌基因)广泛存在于真核细胞，并且其表达产物涉及到细胞的许多生理功能，
参与控制着细胞的生长、增殖和分化；抑癌基因和癌基因作为矛盾的统一体，它们的
基因产物也是信号传递网络中的重要组成元件。另一方面是对细胞周期时钟(cell cycle
clock)的识别，发现所有真核生物从酵母到哺乳类细胞增殖调控机制是一样的，调控
细胞通过G1/S和G2/M转换，在这一机制中发挥核心作用的是一个由基因产物p34cdc2[1]
及其家族与周期蛋白cyclin[2]家族形成的激酶复合体。
人们曾经认为，cyclin B/cdc2直接磷酸化有丝分裂器不同部位的各种结构蛋白，而
成为M期的直接执行者。但最近随着在M期发挥作用的其他激酶的发现，表明同许多
信号转导一样，M期的发生也是一种级联磷酸化的反应，cyclin B/cdc2组成的M期促进
因子MPF[3]位于级联磷酸化的最上游，因而成为诱导者，并且与其他激酶一起各有分
工的磷酸化一套M期结构蛋白和调节蛋白，因而直接和间接地诱导M期的发生。解开
细胞增殖调控之谜不仅对揭示生命活动的规律具有理论意义，而且对提高人类健康水
平具有实际意义。我们将反义cyclin B1基因转染HT29细胞后，鉴定出一株内源性cyclin
B1 mRNA的表达及其生长明显受到抑制的细胞株HTB1。本工作以HT29为对照，系统
观察了HTB1细胞与增殖相关的基因表达变化和生长间的关系。
材料和方法
1.材料
1.1 菌种：大肠杆菌菌株HB101为本实验室保存。
1.2 质粒基因：(1) pCycB1由Tony Hunter教授(The Salk Institute for Biological Studies,
San Diego, California)惠赠。其内部含有人类cyclin B1基因的全长cDNA。该基因大小
为1.45kb，克隆于质粒载体pGEM-4的BamH I酶切位点；(2) pCdc2来源于加州大学，
其内部含有人类cdc2基因的长为2.0kb的cDNA，克隆于pCDVSV40的BamH I位点；
(3) pCycD3由David Beach教授(The Cold Spring Harbor Laboratory, New York)惠赠，其
内部含有人类cyclin D3基因的长为1.96kb的cDNA，克隆于pUC118的EcoR Ⅰ位点；
(4) pCdk4内部含有人类cdk4基因的长为0.3kb的PCR片段，该片段由本实验室扩增、测
序，克隆于pUC18的EcoR I-Hind Ⅲ位点；(5) pMyc由本实验室保存，其内部含有人类
c-my[1] [2] 下一页
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