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m切片，收集切片于前述固定液中固定10min，
依次经浸洗、蛋白酶K(2mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步
处理后，入杂交液(探针浓度500μg/L)于42℃恒温水浴中杂交25h，其后分别经浓度递
减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶1 000)室温中作用
12h，此步完成后分别经0.05mol/L pH7.2 PBS、缓冲液1、缓冲液3漂洗，入新鲜配置的
显色液于室温下黑暗中显色12h，转切片入缓冲液4，并在此液中将切片平铺于涂有粘
附剂的载玻片上，风干切片，1%甲基绿复染15min，然后经系列乙醇脱水、二甲苯透
明，最后用封固剂DPX封片。
原位分子杂交切片对照采用：(1)杂交前用RNA酶100mg/L于37℃预处理切片30min；
(2)杂交液内去除标记探针；(3)杂交液内加入未标记探针。
3.斑点杂交
将用异硫氰酸瓜-酚-氯仿抽提法［11］提取的脊髓RNA水溶液(浓度约为1.4g/L)与
等体积甲醛变性溶液混匀，然后于60℃水浴中变性30min，取出之置室温中冷却，再
将其点到经过预处理的硝酸纤维素膜上，另取标准品(1∶10倍比稀释)同时点膜以做
对照。待膜自然晾干后，将其置于两层滤纸中间转入80℃真空烘烤2h。转移杂交膜
于塑料袋中，按0.2ml/cm2杂交膜面积的比例向袋中加入预杂交液，封口后于42℃预
杂交1h。剪开塑料袋，吸除预杂交液，再按1ml/cm2膜面积加入新配杂交液(标记探针
400μg/L)，封膜后42℃杂交24h。取出杂交膜，用2×SSC-0.1%SDS室温下洗涤数次，
0.1×SSC-0.1%SDS 55℃洗膜2×30min，缓冲液1和缓冲液2各洗2×5min。将杂交膜转
入新配显色液，室温避光过夜显色。
4.结果观察和定量
首先将原位杂交切片做光镜定性观察。然后随即选取3只动物的切片标本，在10
×20倍下每标本随机摄取5个视野，如此每组得到105幅光镜组织学图像(正常对照组
15幅)。在计算机图像分析系统下计数每张图像上的阳性反应细胞数，最后推算出每
100μm2中的面数密度；测量细胞反应强度时，用相同图像分析系统随机在每张图像
上测量10个细胞的反应灰度值，以其平均值表示该动物标本中的反应强度。
斑点杂交结果用真彩色扫描仪扫描入计算机系统，在Photostyler 2.0软件支持下测
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