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李兵仓 王正国 朱佩芳 李应玉 胡 建*廖维宏
(第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042；* 第三军医大学附属西南医院骨科)
摘 要 为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠14d胚胎脊髓(ESC)植
入急性损伤成鼠脊髓后1、3、5、7、10、15和30d，用原位杂交和斑点杂交技术对ESC
和宿主脊髓(HSC)内NT-3 mRNA的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常
脊髓内，NT-3 mRNA以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂
交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ESC植入后，除移植
物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果
表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交
反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组
内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后7d，后者为术后10~15d.我们认为，
移植的ESC除为自身和HSC提供神经营养外，也诱发了HSC在发生过程中曾经拥有的
合成机制，以增强NF表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提
供合适的营养环境。
关键词 脊髓损伤 脊髓移植 神经营养素-3 分子杂交
胚胎脊髓(embryonic spinal cord,ESC)移植不但可以修复成体损伤脊髓(injured spinal
cord,ISC)的组织缺损[1,2]，对恢复ISC功能也有促进作用[3]，并能挽救(rescue)损伤的宿
主神经元[4]。根据神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)不仅对感觉神经元、胆碱能神经
元和多巴胺能神经元发育分化具有维持和促进作用［5,6］，还能挽救脊髓损伤神经元而
免遭变性死亡［7］和促使神经肌肉突触在结构和功能上尽快成熟［8］，我们推测ESC
移植后的生长、分化以及修复ISC组织缺损和救援损伤神经元等作用可能和NT-3有关。
为此，本研究将ESC植入成鼠ISC后，对NT-3 mRNA的变化进行原位和斑点分子杂交观
察，以从神经营养因子(neurotrophic factor,NF)角度探讨移植修复机理。
材料和方法
1.动物处理与取材
按我们以前［2］介绍的方法进行脊髓损伤和脊髓移植。主要方法和步骤：以体重
200g左右的Wistar大鼠脊髓为宿主，以同种妊娠14d(E14)的胎鼠脊髓为受体。移植时先
半切宿主脊髓腰膨大(L1)左侧并吸出局部脊髓组织，然后由孕鼠子宫内取出E14胎鼠，
于显微镜下仔细剥离颈胸段脊髓，用玻璃针头吸取一段长约3mm的纯净胎鼠脊髓，注
入脊髓损伤处。确认植入后，用8-0的无创缝合线间断缝合硬脊膜。术后1、3、5、7、
10、15、30d时，随机取6只宿主鼠做原位分子杂交，另取5只用于斑点杂交。做原位分
子杂交者麻醉后开胸暴露心脏，经左心室\|主动脉系统依次灌注无RNase的PBS 150ml
和4%多聚甲醛200ml。灌注固定后2h取出移植部位脊髓，投入相同固定液继续固定2h，
然后转入20%蔗糖(无RNase)中过夜；欲做斑点杂交的动物麻醉后直接取出移植部位脊
髓，迅速投入液氮中保存备用。
除宿主鼠外，在以上各时相点还另用10只单纯脊髓损伤的大鼠做损伤对照。正常
对照动物总共11只，其中原位杂交用6只，斑点杂交用5只。本实验共用受体鼠77只，
单纯脊髓损伤鼠70只，包括11只正常对照大鼠在内，各种大鼠共计158只。
2.原位分子杂交
人NT-3 cDNA探针(穆援越博士赠送，北京军事医学科学院)片断长0.44kb，连接于
PUC18质粒多克隆位点EcoRⅠ和HindⅢ之间。质粒的扩增、纯化、酶切和基因片段的
回收主要参照文献［９］进行。基因探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒
(德国Boehringer Mannheim Biochemica)说明书操作。原位分子杂交的主要步骤［10］为：
取出蔗糖中过夜标本置冰冻切片机切50μ[1] [2] 下一页
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