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血管内皮生长因子的免疫学测定法 |
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BSA)购自华美公司,多聚赖氨酸、Iodogen、胎牛血清(FCS)购自Sigma公司, RPMI 1640购自Gibco公司。125I购自中国科学院原子能研究所。
1.2 VEGF的表达及分离纯化 VEGF的重组原核表达载体pKPL-3b-VEGF由北京医科大学汤健教授惠赠,以之转化POP-2136菌(北京医科大学马大龙教授惠赠),42℃培养4～6 h诱导外源基因的表达。离心沉淀菌体,超声裂解。离心弃上清。沉淀经终浓度为10%SDS、8 mol/L尿素及2 nmol/L二巯基乙醇变性处理后,进行SDS-PAGE(10%）制备性电泳［7］,切下VEGF的相应带,置透析袋中电泳洗脱,在洗脱液中加入4倍体积的复性液,室温洗脱6～12 h,PBS(pH 7.4)透析24 h。
1.3 VEGF的活性测定 根据杨小平法加以改进［8］。离体24 h以内的人脐静脉,经消化8～10 min获得内皮细胞,其条件培养液为RPMI 1640,含30%FCS、2 mmol/L谷氨酰胺、90 ng/ml肝素钠、1 ng/ml氢化考的松及2 ng/ml庆大霉素。96孔板以0.01%多聚赖氨酸包被后,加原代人脐静脉内皮细胞,4×103个/孔,加入不同浓度的VEGF, 每个浓度有3个重复孔。5 d后加入3H-TdR 1.0 μCi/ml，培养6 h后以(Beckman LS 3801型)液闪仪测其cpm值。
1.4 VEGF抗体的制备及纯化 新西兰白兔以纯化的VEGF免疫,1～2 mg/(只*次)。首次免疫加福氏完全佐剂,背部皮内多点注射。之后每月加强免疫一次,加福氏不完全佐剂。末次免疫10 d后以免疫双扩散测其效价并收集血清。抗血清经等体积饱合硫酸氨沉淀后,以PBS透析。加入自制的CN Activated Sepharose-CL-4B-VEGF亲合层析柱中, 彻底洗脱后,以0.1 mol/L HCl-甘氨酸(pH 2.8)洗脱,并收集峰管,Tris中和后以PBS透析、分装保存。
1.5 肿瘤细胞条件培养液VEGF的放免测定 96孔软板(日本住友,Falcon型)以纯化的VEGF抗体(10 μg/ml)包被过夜,以1%BSA封闭1 h,洗涤后加入待测的细胞培养上清（细胞培养液为RPMI 1640,含15%FCS），室温反应1 h,彻底洗涤后加入125I标记的VEGF抗体（1 μCi/μg,250 000 cpm),室温反应1 h后彻底洗涤,切割后以γ计数器(国营二六一厂 FH 408型自动定标仪)测其cpm值。VEGF抗体的标记采用Iodogen法。
2 结果
2.1 VEGF及其抗体的纯度与活性 VEGF在本原核表达体系中以包涵体的形式存在,经变性、制备电泳及复性可获得一纯度较高的43 kD重组蛋白即人重组VEGF（图1），复性后的蛋白经HPLC的反相层析(Cosmosi14, 6 ×150 mm, Fo9033,5C18-P-300)表现为单一峰,并可显著刺激人脐静脉内皮细胞的生长,并呈剂量依赖关系（图2）。以其免疫制备的VEGF抗血清的滴度(免疫双扩散)可达1∶32,分离纯化后仍维持与VEGF的结合活性。
图1 人重组血管内皮生长因子SDS-PAGE分析
Fig.1 Analysis of recombinant VEGF product (pKPL-3b-VEGF in POP-2136)
Note:Lane 1.total cell extracxt of control bacteria not transformated with pPKPL-3b-VEGF; Lane 2. total cell extract of pKPL-3b-VEGF transformed bacteria in non temperature induced condition; Lane 3. total cell extract of pKPL-3b-VEGF bacteria in temperature-induced; Lane 4.supernatant from total cell extract from induced bacteria; Lane 5. inclusion body ;Lane 6. supernatant of inclusion body;Lane 7. inclusion body after washing； Lane 8. purified recombinant vascular end上一页 [1] [2] [3] 下一页
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