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试用ICAM |
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miths博士惠赠；T7 DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司，32P-dATP购自北京亚辉公司；鼠抗入CD54、HLA-DR单抗购自北京中山生物技术有限公司；TSST-1、人基因工程重组IFN-γ购自军事医学科学院。
1.2 噬菌体十五肽库的筛选［5］ 链亲合素包被聚苯乙烯培养皿［5］，4℃过夜，2% BSA封闭37℃ 1 h，TBS洗3遍，加入生物素化抗ICAM-1抗体4℃过夜，次日洗去未结合的噬菌体，测滴度用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，回收率稳定。
1.3 阳性克隆噬菌体单链的制备 取4轮筛选物测滴度，随机挑取40个单克隆经扩增、PEG沉淀回收噬菌体，200 μl TBS溶解测滴度，留100 μl备用，另100 μl经酚：氯仿/异戍醇抽提、乙醇沉淀后经琼脂糖电泳证实。
1.4 阳性噬菌体克隆DNA序列分析 用Sanger双脱氧末端终止法对所提单链进行测序，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。电压2 200 V，预电泳30～40 min，正式电泳3～4 h。
1.5 含有保守序列的阳性克隆噬菌体的阻断活性检测
1.5.1 经尼龙毛柱法分离T淋巴细胞 流式细胞仪检测T细胞纯度为94.2%，台盼蓝排除试验，细胞活力在98%以上。调细胞浓度1×106/ml。
1.5.2 角朊细胞培养参照文献［6］ 取培养1 w的角朊细胞经IFN-γ(500 U/ml)处理48 h，取少量细胞置Cytospin制片，应用免疫细胞化学染色法检测ICAM-1及HLA-DR，剩余细胞调成浓度1×106/ml备用。
1.5.3 经扩增的单克隆噬菌体及野生型噬菌体 Fusel经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌测滴度为1×107/ml备用。
1.5.4 T细胞增殖阻断试验 于96孔细胞培养板内加入1×105/孔 IFN-γ处理的KC，加丝裂霉素(终浓度25 μg/ml)37℃水浴30 min后弃上清，实验组加入含保守序列的阳性克隆噬菌体，对照组加入空载体Fuse-1，共设106、105、104、103、0共5个梯度，最后各孔均加含TSST-1(终浓度10 μg/ml)的T淋巴细胞悬液100 μl(含1×105细胞)37℃ 5%CO2培养48 h后，用MTT法检测。
2 结 果
2.1 筛选及单链提取 经4轮筛选回收率稳定在10-5～10-6，所提单链DNA分子量位于9 000 bp(图1)。
图1 阳性克隆单链DNA琼脂糖电泳
Fig.1 Electrophoretic analysis of positive phageclonal ssDNA
2.2 测序结果 共得到12个可读序列，保守序列为5’-ATTACTCGCAGTTTTGAGTCTAGTATGGAGCCTGGTCCGCCTGGT-3’(图2),经推断其氨基酸序列为Ile-Thr-Arg-Ser-Phe-Glu-Ser-Ser-Met-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly即ITRSFQSSMEPGPPG。
图2 阳性克隆的保守核苷酸序列
Fig.2 Conservative nucleotide sequence of positive phage clone
2.3 KC表达HLA-DR及ICAM-1免疫细胞化学染色 结果表明IFN-γ处理的KC可表达HLA-DR分子及ICAM-1阳性反应细胞膜呈棕褐色物质沉着，而IFN-γ未处理的角朊细胞不着色(图3、图4)。
图3 免疫组织化学染色检测KC表达HLA-DR(A)和ICAM-1(B)
Fig.3 Observation of HlA-DR(A) or ICAM-1(B)expressed on the surface of KC;by immunohistochemistry staining
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