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人白细胞介素4在大肠杆菌中的优化表达 |
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因表达的经验，利用计算机辅助设计起始密码子(AUG)上下游的序列，根据该局部二级结构的自由能来选择对表达影响最小的局部序列，以提高基因表达时的翻译水平。同时，在目的基因的下游插入部分大肠杆菌LacZ序列试图以此来提高mRNA的稳定性，从而进一步提高基因的表达量。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 质粒和菌株 克隆、测序、表达一体化载体pLCM182由本室构建［7］；大肠杆菌DH5α购自Gibco。
1.1.2 主要实验试剂 淋巴细胞分离液(ρ=1.077)购自Sigma；异硫氰酸胍购自Fluka；反转录采用Gibco Superscript Preamplification试剂盒；各种工具酶均为Promega公司产品；人IL-4标准品购自Gibco(5×106 U/mg)。
1.1.3 主要实验材料 正常成人外周血来自作者本身。PCR引物：上游ATAATGCACAAGTGCGATATCACCTTA；下游TTGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAATA由Cybersyn公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的设计与载体的选择 利用计算机辅助设计起始密码子(ATG)上下游序列，根据局部二级结构的自由能来选择对表达影响较小的局部序列，选择从SD到ATG的局部序列为AATTA。本室构建的克隆、测序、表达一体化载体pLCM182在其多克隆位点后携带部分大肠杆菌的LacZ序列，该序列具有一定的稳定mRNA的作用。
1.2.2 人IL-4基因的克隆 正常成人外周血经梯度离心(梯度离心液ρ=1.077)后，收集交界层的PBMC，以Hank s液洗3遍后，以1×106在含20 μg/ml PHA的PRMI1640培养基中培养，置于37℃，5%CO2中培养48 h后收集细胞，以异硫氰酸胍一步抽提法得总RNA后反转录。PCR参数为95℃ 20 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。特异扩增条带根据人IL-4基因中所包含的酶切点初步鉴定。
1.2.3 人IL-4基因在载体中的定向克隆 克隆、测序、表达一体化载体由本室构建，将pLCM182用EcoR Ⅱ BamH I 酶切，制备成一平一粘的载体片段；同时PCR产物也经BamH I酶切制备成一平一粘的基因片段。两个片段在T4 DNA 连接酶的催化下于16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态菌。挑取阳性转化子作小量制备及酶切鉴定。能被Pst I单酶切下一约260 bp片段的克隆为阳性克隆。
1.2.4 人IL-4在大肠杆菌中的诱导表达 取鉴定为阳性的克隆菌在32℃下培养至平台期，以1%转接至SOB、LB、2×YT中，在32℃振摇至OD值约为0.4时，迅速转入42℃中继续振摇4 h，收集细菌以SDS-PAGE分析人IL-4的表达。
1.2.5 表达的IL-4生物学活性的检测 挑选一表达克隆在2×YT中诱导表达后收集菌体，重悬在约1/5体积的裂解缓冲液中(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0;1 mmol/L EDTA;100 mmol/L NaCl,1 mmol/L PMSF)超声粉碎后收集碎片，用含4 mol/L尿素的裂解缓冲液洗3遍，溶于8 mol/L的尿素中，在4℃存放过夜，以PBS梯度透析后测定生物学活性。生物学活性测定用MTT法，反应性细胞株为TF1，人IL-4的标准品为Gibco产品。
2 结 果
2.1 人IL-4基因的PCR扩增及酶切鉴定 以PHA刺激的正常成人PBMC的mRNA为模板，经PCR扩增出一约400 bp的条带，该条带经Pst I酶切后产生两个大小分别为150和250 bp的片段，初步确定其为人IL-4基因(图1)。
图1 人IL-4基因片段的PCR扩增结果
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