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琼脂集落形成实验检测造血生长因子集落刺激活性方法的改进 |
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1640培养基中，24孔培养板中每孔加325 μl上述细胞悬液(含细胞1×105)，加入待检样品50 μl，混匀。吸取预热的1.2%琼脂125 μl，轻柔而迅速地与上述细胞悬液和待检样品混合液于24孔板中混匀，注意勿产生气泡。自然凝固后，置37℃、5% CO2孵箱中培养，至8～10 d后，于倒置显微镜下观察。
1.4 标本的固定、制片及染色 24孔板中加入Hank′s液，室温放置15 min。小心吸去Hank′s液，加入3%戊二醛固定液覆盖琼脂层，室温固定10 min，吸去固定液，将24孔板轻轻放入蒸馏水中浸没(防止水流将琼脂层冲出)，除去盐和固定液。轻轻取出软琼脂层，置于载玻片上，用预先湿润的醋酸纤维素膜或少纤维滤纸覆盖其上，待室温自然干燥后，用蒸馏水湿润覆盖其上的纤维素膜后，将纤维素膜轻轻揭去，完成制片。平放玻片，滴加瑞氏-吉姆萨染液5～8滴，染色1 min。滴加磷酸盐缓冲液5～12滴，染色15 min，放置低倍镜下观察，如染色适度，核浆染色分明，即可以流水冲洗。干燥后镜检。
1.5 集落鉴定、计数 镜下可根据典型的形态学特征鉴定GM-CFU，E-CFU和M-CFU，50个细胞以上确认为一个GM-CFU。4个以上聚集的巨核细胞确认为一个M-CFU，集落中含有2个或2个以上不同系造血细胞时确认为混合集落(Mix-CFU，包括GMM-CFU，GEMM-CFU)，巨核细胞集落可用乙酰胆碱酯酶染色确定。
2 结 果
我们将这种改进的方法应用于造血因子的生物学活性测定及造血调节的研究中，证实这种方法是简单，易行，可靠的［3，4］。培育5 d后即可在倒置显微镜下对集落生长做初步的观察；培育10 d后，在倒置显微镜下可以观察到多种典型集落形成。经固定制片后，可以经瑞氏-吉姆萨染色或乙酰胆碱酯酶染色对集落的性质进行进一步的鉴定(见图1及图2)。
图1 倒置显微镜下集落生长情况(第10天，200×)
Fig.1 Colony observed under reverse-phase microscope(10th day,200×)
图2 瑞氏-吉姆萨染色后光镜下观察(40×)
Fig.2 Colony observed under microscope after Giemsa stain(40×)
3 讨 论
同传统的琼脂集落实验相比，本文介绍的方法有如下几个优点：①不需特殊的器材和设备，培养体积小，易于操作。②制片方法简单，可长期保存，封片保存效果更佳。③固定后的玻片适合于多种染色，效果好，易于计数。④易于对集落进行鉴定：在瑞氏-吉姆萨染色方法下即可辨识GM-CSF，E-CSF，M-CSF及Mix-CSF。也可通过特异性染色方法鉴定。⑤检测多能或定向造血生长因子可直接采用本法。在加入亚适剂量的IL-3或其替代物的情况下，可以检测其它与IL-3有协同作用的造血生长因子。⑥此方法适用于人及小鼠的实验系统，除反映造血生长因子的活性外，还可反映不同患者骨髓造血干细胞对造血生长因子的反应性，以指导临床治疗。本文介绍的琼脂集落形成实验为实验室及临床检测造血生长因子的活性提供了一种简便易行的实验方法。
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