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牛膝多糖对人胸腔巨噬细胞的激活作用 |
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培养的人胸腔巨噬细胞(thoracic cavity macrophages ,TMφ)、内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH，EC 1 ,1 ,1 ,27 )和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP, EC 3,1,3,2 )活性的调节作用，以及ABPS对人TMφ表达肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 ABPS为白色结晶粉末，纯度为99.9％，由中国科学院上海有机化学研究所田庚元教授提供；RPMI1640细胞培养液购自Gibco公司，TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供； LDH试剂盒由上海长征医学科学技术有限公司生产；ACP试剂盒为本系自配。
1.2 ABPS细胞培养液配制 准确称取ABPS 1.000 g溶解于适量RPMI1640细胞培养液，用5％NaHCO3 调pH至7.2～7.4，定容至100 ml，蔡氏滤器0.22 μm微孔滤膜无菌过滤，配制成含10%新生牛血清的10 mg/ml ABPS-RPMI1640细胞培养液，再用含10％新生牛血清的RPMI1640稀释成ABPS浓度为5.000,2.500,1.250,0.625,0.312 mg/ml的RPMI1640细胞培养液。
1.3 TMφ的分离、培养与破碎 抽取多发性骨髓瘤病人左侧胸腔积液，总量为650 ml，无菌室内用50 ml圆筒离心管分次离心收集沉淀细胞，用含10％新生牛血清的RPMI1640悬浮沉淀细胞，并在流式细胞仪(美国 BETON DICKINSON 公司产品，型号为FACSCal:bnr)上计数调节单核细胞6×105 ml-1, 加入96孔细胞培养板，每孔0.3 ml，于37℃培养箱培养2 h，弃上清及非贴壁的细胞，贴壁的为TMφ，加不同浓度的ABPS-RPMI1640细胞培养液，每孔0.3 ml，每种浓度重复6孔，37℃培养24 h ，吸去每孔中的细胞培养上清液，用Hank’s液洗涤贴壁的TMφ后，每孔加0.2 ml双蒸水，超声波清洗机上振摇2 min，置-30℃冰箱，通过-30℃、+30℃反复冻融5次破碎Mφ，制成破碎的TMφ悬液。
1.4 LDH测定 采用Wahlefeld方法，以L-乳酸为底物全自动生化分析仪上速率法测定NADH+H+的生成(全自动生化分析仪由日本日立公司制造，型号为7170)，反应体系为：温度37℃，破碎的TMφ悬液18 μl，延迟时间30 s，反应总体积360 μl，每隔15 s测1点，共测34点，以19～24连续6点直线回归求值。酶活力单位采用国际单位(U)，即每升破碎的TMφ悬液37℃每分钟使1 μmol乳酸转化为丙酮酸所需的酶量为1 U。
1.5 ACP测定 采用全自动生化分析仪(日立7170)双试剂终点法，R1为基质液(对硝基苯酚磷酸酯-柠檬酸buf,pH5.0)，R4为1 mol/L NaOH，λ1 405 nm,λ2 546 nm，反应体系为：破碎的TMφ悬液10 μl，R1 200 μl,反应10 min (测定34点) 后加R4 100 μl终止反应求值,酶活力单位采用国际单位(U), 即每升破碎的TMφ悬液在pH5.0、37℃、每分钟水解1 μmol 对硝基苯酚磷酸酯为对硝基酚所需的酶量为1 U。
1.6 TNF-α和IL-6测定 采用放射免疫分析法，操作按试剂盒说明书。
1.7 统计分析 数据以±s表示，用t检验分析组间的显著性差异。
2 结 果
2.1 ABPS对TMφ酶活性的调节作用 表1所示，ABPS的5种不同浓度均对TMφ内LDH活性具有上调作用，其中0.625和1.250 mg/ml ABPS浓度对LDH活性的调节作用与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)，这一结果表明ABPS对TMφ内LDH活性具有上调作用，但无显著的剂量效应；ABPS对TMφ内ACP活性虽有上调作用，但上调的幅度较小与对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。
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