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肥大细胞与肺成纤维细胞共育的形态学观察 |
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尹红玲 钱仲棐
(湖南医科大学病理学教研室，长沙 410078)
摘 要 用分离纯化的大鼠腹腔肥大细胞(PMC)与同源胎鼠肺成纤维细胞(LFb)共育，
对LFb进行形态学观察和形态计量分析。结果表明：与PMC共育的 LFb 呈复层生长，单
位面积内细胞计数明显增加，粗面内质网(RER)增生。电镜见PMC与LFb紧密接触和部
分PMC有脱颗粒现象。提示PMC可促进LFb增值，并使其功能活跃。
关键词 肥大细胞 成纤维细胞 形态学 形态计量 共育
近年来，肥大细胞(mast cell,MC)促进成纤维细胞增生以及MC在纤维化病变发生发
展中的作用，已引起人们的重视[1]，但国内很少有研究报道[2]。本实验采用正常大鼠
腹腔肥大细胞(peritoneal mast cell,PMC)与同源胎鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast,LFb)共
育，观察PMC与LFb的形态学变化，为探讨MC在肺纤维化过程中的作用提供形态学依
据。
材料和方法
1.实验动物
Wistar 大鼠，体重约 200g，雌雄不限，供采集 PMC。取妊娠13～15d Wistar 胎鼠
用作分离 LFb。以上动物均由本校实验动物学部提供。
2.PMC 采集分离
2.1 PMC分离液的配制：取比重1.120的40%Ficoll溶液 50ml,用比重1.077的淋巴细胞
分离液调整比重至1.085，用于分离PMC。(Ficoll溶液和淋巴细胞分离液均为上海试剂二
厂产品)
2.2 PMC采集分离：参照本室使用的梯度密度分离PMC 方法[3]，于无菌条件下收集
大鼠(6只)腹腔冲洗液，离心后取其细胞悬液，沿管壁缓慢加入盛有PMC分离液的离心
管中，使两液形成界面，4℃、2500r/min离心15min,PMC沉于管底，倾去上层液体，取
底部PMC用冷无 Ca2+、Mg2+的PBS 清洗 2次(4℃，1 000r/min离心10min)后，于RPMI-
1640 培养液悬浮备用(甲苯胺蓝染色，光镜下计数PMC纯度达95%以上)。
3.LFb分离培养
按本室建立的方法分离培养LFb[3]。
3.1 试剂与培养液：(1)胰蛋白酶1∶250，Sigma公司)用PBS液配制成0.1%溶液供原
代和传代消化用；(2)无Ca2+、Mg2+PBS液；(3)完全培养基：RPMI-1640(日本日水制药
株式会社)加15%小牛血清(杭州四季青生物制品公司)和青霉素(1×105U/L)、链霉素
(100mg/L)，用7.4%NaHCO3 调整pH至 7.4±0.1。
3.2 分离培养 LFb：胎鼠 20只，无菌条件下取肺，生理盐水清洗后剪成约 0.2cm3
碎块，胰蛋白酶室温下消化10min,以完全培养基中止消化后离心，取组织块接种于培
养瓶内，24h后组织块边缘长出贴壁细胞并逐渐展开连接成片，呈辐射状排列，待长满
瓶底时传代(约5d)，然后每2d传代1次，经6～7次传代后取得自然纯化的LFb，供实验
用。
4.PMC 与LFb共育
消化收集纯化的 LFb,以3×105/ml细胞数分别接种于25ml 培养瓶内，或置有盖玻片
的培养皿内。于第3d换液后，共育组加入PMC悬液1ml(含105个PMC)；对照组不加PMC
(至第3d换液1次，换液后不加PMC)，共育5d中止培养，取培养细胞进行下述形态学观
察和形态计量分析。
5.观察方法
5.1 光镜：取盖玻片培养细胞分别作苏木素-伊红(HE)染色和甲苯胺蓝染色，光镜观
察。
5.2 透射电镜：共育组和对照组各取8瓶培养细胞，分别用2.5%戊二醛固定1h,刮取
贴壁细胞，制成悬液，1 000r/min离心15min，PBS清洗2次，再离心取沉淀细胞加入5滴
血浆，混匀后4 000r/min 离心 30min,弃上清液，沉淀物为凝结的细胞团块，再加2.5%戊
二醛固定1h，锇酸后固定1h，取出细胞团块沿中线对半切成两份，[1] [2] 下一页
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