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抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究 |
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ice challenged with B16 melanoma cells.Conclusion:The results demonstrated that specific antitumor immune responses cound be induced efficiently by vaccination with tumor antigen gene-modified DC.
Key words Dendritic cell Antigen Gene modification Adenovirus CTL Vaccine
树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前所知的是功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Nat-ive T cell) 的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)，在免疫应答中处于中心地位。近年来体外大量扩增DC的方法日益成熟，使DC用于肿瘤治疗受到重视［1，2］。Porgador 等用MHC I类分子限制的肿瘤抗原多肽体外致敏的DC免疫小鼠，不但诱导产生了特异性CTL，同时也使小鼠获得了抵抗肿瘤再攻击的能力［3，4］。本室曾用GM-CSF基因修饰的DC经肿瘤抗原体外致敏后或与肿瘤细胞融合后免疫小鼠，使小鼠产生了更强的特异性抗肿瘤免疫反应［5，6］。若将肿瘤抗原基因转染至DC并使之持续表达，有可能更有效地发挥DC的抗原提呈作用，而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。Chen等曾以LacZ基因作为模拟的抗原基因、以其表达产物β-半乳糖苷酶(β-gal)作为模拟的抗原并以转染了LacZ基因、能稳定表达β-gal的胸腺淋巴瘤细胞EL-4的亚克隆E22为模型研究抗原特异性抗肿瘤免疫反应［7］，鉴于将β-gal为模拟抗原的实验体系稳定、简便、明确，因此，我们利用E22为肿瘤细胞模型，通过携带有编码LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)的介导，探讨腺病毒介导的抗原基因修饰的DC能否诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，为以DC为基础的肿瘤主动性免疫基因治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞株 C57BL/6小鼠(H-2b)，6～8周龄，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。胸腺淋巴瘤细胞株EL-4(为C57BL/6小鼠来源)以及稳定表达β-gal的IL-4细胞亚克隆细胞株E22(来自转移有编码LacZ基因的EL-4，用含400 μg/ml G418的RPMI 1640培养基选择培养，X-gal染色率100%)均由美国克利夫兰医学中心陈卫博士惠赠；B16为C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞株，本室常规传代。
1.2 主要试剂 携带编码LacZ基因重组腺病毒AdLacZ)及E1区缺陷的腺病毒Ad5，由日本癌症研究所基金会Hamada博士惠赠；大鼠抗小鼠单抗CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1.1-PE和FITC标记的羊抗大鼠荧光二抗均购自PharMingen公司，抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia、FcR、和33D1的单抗为本室从常规培养的杂交瘤上清中纯化所得，mGM-CSF和mIL-4均购自Sigma公司，同位素3H-TdR、Na251CrO4均自Amersham公司。
1.3 骨髓树突状细胞的培养 参考Inaba的方法略作修改［8］，取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH4Cl溶去红细胞，PBS洗2次后，用大鼠抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia和FcR混合单抗液重悬，4℃孵育45 min，洗涤后加入低毒兔补体(1∶10稀释)，37℃介溶45 min，PBS洗2次后，用含重组mGM-CSF（3.3 ng/ml）和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基于6孔培养板上培养(1×106 cell/ml)。第3天，轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，补入新鲜的含同样浓度mGM-CSF和mIL-4的完全培养基，第6天收集非粘附细胞和疏松粘附的增殖性树突状细胞聚集体，于培养瓶中继续培养2 d，收集悬浮的细胞即为DC。
1.4 DC的基因修饰及修饰后的DC对小鼠的免疫 收集第8天的DC，调整至1×106 ml-1于6孔培养板上，以MOI值50加入AdLacZ或Ad5，37℃，1 h后补加正常培养液，24 h后，收集并洗涤2次。X-gal染色以明确转染效率及转染后24、48和72 h的AdLacZ表达情况。以3.5×105/只给小鼠右后肢股外侧皮下免疫。
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